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RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）分析技術(shù)
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實(shí)驗(yàn)方法原理 RAPD作為單引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其產(chǎn)生機(jī)理是引物首先結(jié)合到模板鏈，沿模板5’端方向延伸而產(chǎn)生不同長度的DNA片段，然后以這些片段為模板繼續(xù)大量擴(kuò)增。由于RAPD反應(yīng)中，在3’端沒有相應(yīng)引物和模板互補(bǔ)，這樣必然存在一個(gè)由引物沿模板DNA 5’端方向延伸后再在3’端形成同一引物互補(bǔ)序列的過程。 有人提出，在RAPD反應(yīng)過程中，擴(kuò)增可能存在一些這樣的分子模式： （1）5’端帶有引物的單鏈DNA分子在3’端發(fā)生折轉(zhuǎn)、自身結(jié)合和延伸，并在3’端形成同一引物的互補(bǔ)序列，變性展開后即可成為單引物PCR擴(kuò)增的模板分子。 （2）通過兩條5’端各帶同一引物的單鏈DNA分子拼聯(lián)來實(shí)現(xiàn)。 （3）對基因組DNA分子的顛倒重復(fù)序列而言，如果引物的結(jié)合位置正好處于這些序列的3’端，那么在其DNA片段的兩條單鏈上就分別具有一個(gè)引物的結(jié)合位置和它互補(bǔ)的序列，成了RAPD擴(kuò)增的模板分子。在雙引物通用PCR中這種情況很少，但由于RAPD所用引物短，又在低溫下退火，這增加了引物和顛倒重復(fù)序列結(jié)合的機(jī)會，完全有可能產(chǎn)生RAPD。 實(shí)驗(yàn)材料 模板DNA 試劑、試劑盒：寡核苷酸引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、礦物油、電泳所需試劑 儀器、耗材：PCR擴(kuò)增儀、電泳裝置、微量離心機(jī)、微量移液器、Eppendorf管、紫外線觀察裝置及照相設(shè)備 一、 試驗(yàn)條件 1. 藥品試劑 （1）模板DNA（10～100 ng） （2）寡核苷酸引物（20 mmol/L貯存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司購買，也可以自己合成） （3）0.2 mmol/L dNTPs（必須使用高質(zhì)量的dNTPs，這一點(diǎn)非常重要。dNTPs經(jīng)反復(fù)化凍后會發(fā)生降解，因此應(yīng)分成小份保存。應(yīng)注意混合物中四種dNTP的量要相等） （4）Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer，Norwalk，Connecticut） （5）10×PCR緩沖液（500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，100 mmol/L Tris HCl，pH 8.3） （6）礦物油 （7）電泳所需試劑 2. 儀器設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀、電泳裝置、微量離心機(jī)、微量移液器（1～20 ml和20～200 ml）、0.5 ml Eppendorf管、紫外線觀察裝置及照相設(shè)備。 二、 操作程序 1. 在冰里向無菌的Eppendorf管中加入以下反應(yīng)物： 水： 14.75 ml 10×緩沖液： 2 ml 10×dNTPs：2 ml 引物（20 mmol/L）：0.2 ml Taq DNA聚合酶 終體積 DNA（10～100ng）：1 ml 石蠟油 ：20 ml 2. 93℃反應(yīng)2 min后開始如下循環(huán)： 93℃變性反應(yīng)：1 min 36℃退火反應(yīng)：1 min 72℃延伸反應(yīng)：1.5 min 經(jīng)過45個(gè)循環(huán)后，最后一個(gè)循環(huán)72℃增加5 min，循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于4℃保存。 3. 20 ml反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色檢測擴(kuò)增的情況。 |
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