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vulture1206銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
重組載體準(zhǔn)備 已有3人參與
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小弟準(zhǔn)備構(gòu)建一個(gè)表達(dá)載體：使用pET-44a載體， Pst I 和Sal I內(nèi)切酶�？墒荖ovagen的說明書說用3ug的載體來消化用于連接目的基因�？墒俏覀儗�(shí)驗(yàn)的載體是以plasmid的形式保存的，而且濃度是30ng/ul。請問大蟲們，這個(gè)是要怎么整？ 還有，我把載體消化、跑膠之后回收，為什么濃度會低到只有8ng/ul？我用來消化的載體量有1ug左右。乙醇沉淀沒辦法濃縮，已經(jīng)嘗試過很多次了。 求助啊…… |
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原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-02-07 18:23:34
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-02-07 18:23:34
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不清楚你連接后轉(zhuǎn)化的宿主是什么菌，對載體連接體系各成分的濃度要求這么精確么？看你用的pet載體，應(yīng)該是連接轉(zhuǎn)化大腸吧，這個(gè)感覺是沒有必要糾結(jié)這么細(xì)節(jié)的要求，當(dāng)然載體和片段酶切處理那一步保證酶切完全很重要，其他的載體回收后濃度降低很多都不是大問題呀，平時(shí)的實(shí)驗(yàn)中，載體2微升的電泳圖可以看到有條帶，隱隱約約都可以的，取1微升用于連接就可以，按說明書把握各個(gè)細(xì)節(jié)，會很糾結(jié)，并且嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)效率。熟練之后，其實(shí)大家都不怎么去關(guān)注過片段的精確濃度，電泳大概估算即可。祝好。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2017-02-07 00:30:51
kangaroo0513
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3樓2017-02-07 15:58:53
vulture1206
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4樓2017-02-08 12:51:13
vulture1206
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5樓2017-02-08 12:53:13
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6樓2017-02-08 16:07:07
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7樓2017-02-09 18:26:46
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8樓2017-02-10 17:58:09
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