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小木蟲論壇-學術(shù)科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 免疫實驗 » 雌二醇檢測實驗
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雌二醇檢測實驗 已有2人參與
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實驗方法原理 采用標記有雌二醇單克隆抗體的膠體金顆粒與相對應(yīng)的固定在硝酸纖維膜上的雌二醇結(jié)合物相結(jié)合，固定有雌二醇結(jié)合物的檢測線處就顯現(xiàn)明顯的顏色。 實驗材料 雌二醇抗體 試劑、試劑盒： 氯金酸、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗、雌二醇 儀器、耗材： 硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、分光光度計、低溫高速離心機、點膜機 一、試劑與儀器 氯金酸；牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗；雌二醇標準品、雌二醇單抗、17β-Estradiol-6-one6-(o-carboxymethvyoxime)。硝酸纖維膜、玻璃纖維膜；Beckman Du530分光光度計；低溫高速離心機；點膜機。 二、 方法 1. 膠體金的制備 用三蒸水溶解氯金酸，使其終濃度為01g/L,先進行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100 ml加入1%檸檬酸三鈉25ml，再沸水浴下快速攪拌，直到氯金酸溶液的顏色穩(wěn)定，繼續(xù)沸水浴10 min，冷卻至室溫后，用透射電鏡鏡檢并用分光光度計檢測顆粒均勻度及粒度。最后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br /> 2. 最適標記蛋白量的確定 用0.2mol/L K2CO3將膠體金溶液調(diào)至pH為8.2，然后取試管9支，分別加入10 ml膠體金溶液。將雌二醇抗體逐級稀釋后，各取等體積稀釋液順序加入上述試管中，混勻，另設(shè)一不加抗體的對照管。放置10 min，在各管中加入0.1 ml的10% NaCl，混勻后靜置2 h。觀察各管中膠體金溶液變化，未加蛋白及加入量不足的溶液顏色由紅變藍，而加入蛋白量達到或超過時的溶液則保持不變。標記蛋白量即為最低穩(wěn)定膠體金溶液不變色的蛋白量基礎(chǔ)上再加20%。 3. 膠體金探針的標記 將抗體用0005mol NaCl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉淀，調(diào)至05mg/ml。取膠體金100 ml，用0.2 mol/L K2CO3將膠體金溶液調(diào)至pH為9.0，磁力快速攪拌下緩慢加入24 ml稀釋的雌二醇抗體，繼續(xù)攪拌10 min，加入牛血清白蛋白(BSA)，使其最終濃度為1%，再攪拌10 min。將初步制得的膠體金探針以4 000 r/mm離心20 min；棄沉淀，上清以10 000 r/min離心60 min；棄上清，沉淀用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)(含1%牛血清白蛋白)重新懸��；同前離心洗滌2次，將沉淀用0.1 mol/L的PBS(pH82，含1%BSA，002%NaN3)懸浮，4℃保存?zhèn)溆谩?#160; 4. 抗原的合成 小分子物質(zhì)難以固定在硝酸纖維膜上，只有使它連上大分子物質(zhì)才能較好地固定。本實驗采用混合酸酐法制備完全抗原。雌二醇-6-肟 43 mg，加入三正丁胺5 μl，二氧六環(huán)4 ml，冰浴冷卻到10℃以下，加入氯甲酸乙酯15 μl。4～10℃下反應(yīng)30 min。配制卵清白蛋白(OVA)溶液(OVA 10 mg，3ml水，3 ml二氧六環(huán)，1mol/L氫氧化鈉03ml)。將配制好的OVA溶液加入反應(yīng)液，4℃冰浴攪拌6h，反應(yīng)過程中，用氫氧化鈉維持pH值為8.反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液加入透析袋，透析2 d。將透析液調(diào)至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉淀出現(xiàn)。離心收集沉淀，冷凍干燥，4℃冰箱保存。將OVA溶于透析液內(nèi)作為參比，用紫外光譜法對雌二醇-6肟-OVA進行定性檢驗。經(jīng)紫外測定證明蛋白質(zhì)已與雌二醇衍生物結(jié)合。 5. 膠體金免疫層析試紙條制備 測試條由玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、加樣紙、吸水紙4部分組成。將玻璃纖維膜裁成6mm的細條，然后放入含1% BSA、1%Tween-20的PB液中浸泡30 min，37℃烘干，最后將膠體金探針灌注已處理好的玻璃纖維膜上，真空干燥備用。在硝酸纖維膜上用點膜機將上述抗原和兔抗鼠IgG噴成2條線，分別為檢測線和對照線，經(jīng)真空干燥后，用1% BSA、0.1mol/L PBS（pH9.0)封閉2 h，以0.1 mol/L PBS洗滌，再真空干燥。將30 mm吸水紙、25 mm硝酸纖維膜、6 mm玻璃纖維膜、15 mm加樣紙，由頂部依次粘于PVC板上，裁成細條備用。 6. 檢測與判讀樣品 含已知濃度雌二醇樣品的乙醇溶液分為3組，第1組不加雌二醇，第2組為0.2 μg/ml雌二醇，第3組為0.4 μg/ml雌二醇。將加樣紙一端插入待測液，濕潤后取出，水平放置，約3～5 min，觀察結(jié)果。如試紙條硝酸纖維膜上僅對照線呈一條紫紅色帶為陽性；如出現(xiàn)2條紫紅色帶為陰性；如質(zhì)控線不出現(xiàn)紫紅色帶，無論檢測線是否出現(xiàn)，測試結(jié)果均無效。 |
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