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請問在用cfDNA構(gòu)建二代測序文庫的時(shí)候用磁珠去除大片段的原理是什么？ 已有3人參與
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請問在用cfDNA構(gòu)建二代測序文庫的時(shí)候有個(gè)去大片段的步驟，用磁珠去除大片段的原理是什么？ 實(shí)驗(yàn)步驟如下： 1 DNA 片段末端補(bǔ)平 * 將末端補(bǔ)平試劑置于冰盒上溶解；（注意：Mix反應(yīng)混合液配制應(yīng)在冰盒上進(jìn)行�。┰噭⿷�(yīng)該提前從冰箱拿出，在冰盒上溶解！ * 配制Mix 1：準(zhǔn)備一個(gè)1.5ml EP管，標(biāo)號為Mix 1，在冰盒上根據(jù)樣品數(shù)配制，每個(gè)樣本應(yīng)多配10%； * Components 1RXN (uL) 24RXN (uL) 48RXN (uL) Remarks * 10×Buffer2.1 5.0 132.0 264.0 * dNTP 0.50 13.20 26.40 * T4 Polymerase 0.20 5.28 10.56 * PNK 1.00 26.40 52.80 * Total 6.70 176.88 353.76 * 用單槍把配制好的Mix 1混合液按照上表分裝到8連排PCR管中； * 用EP-10排槍吸取Mix 1混合液6.7μl到裝有43μl DNA樣品孔中，用同一槍頭吹打潤洗殘留在槍頭壁上的Mix混合液，輕微震蕩混勻后離心數(shù)秒（注：吹打時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，最后一槍可緩慢打下，若有氣泡產(chǎn)生可進(jìn)行輕微離心消除）； * 將96孔反應(yīng)板置于pcr儀上反應(yīng)，反應(yīng)程序：25℃,30min；75℃，10min；4℃，hold；（距反應(yīng)結(jié)束還有10min時(shí)，可預(yù)先準(zhǔn)備Barcode和配制mix2） * 反應(yīng)結(jié)束后，取出96孔板輕微震蕩離心； 2 去除大片段： * 用EP-100排槍加入MV Beads40ul（1：0.8）,吹打混勻20次左右，室溫（20 -25℃）5分鐘； * 將96孔板插入96孔磁鐵板（DynaMag-96 Side)， 待溶液變澄清之后，用EP-300排槍將上清液(~89uL)全部轉(zhuǎn)移到同一96孔板的下一排孔中。 * 末端修復(fù)后純化； * 移除磁鐵板，緊接用EP-100 排槍加入107μl（1：1.2） MV Beads; 吹打20次左右混勻；室溫（20 -25℃）5分鐘； * 將96孔板插入96孔磁鐵板，待磁珠吸附完全溶液變澄清之后（約15分鐘左右）； （ ） 3 DNA片段末端連接反應(yīng) * 配制Mix 2：標(biāo)記1.5ml EP管為Mix 2， 在冰盒上根據(jù)樣品數(shù)配制，每個(gè)樣本多配10% ；（注意：Mix反應(yīng)混合液配制應(yīng)在冰盒上進(jìn)行！試劑提前冰箱拿出，冰盒上溶解�。� * Components 1RXN (uL) 24RXN (uL) 48RXN (uL) Remarks * H2O 0 0.0 0.0 * 5×Ligation Buffer 8 211.2 422.4 * P1 Adapter（1：10） 1 26.4 52.8 * DNA ligase 2 52.8 105.6 * Total 11.00 290.40 580.80 * 待溶液變澄清，將吸去上清液（丟棄），注意不要吸到磁珠（可分次吸去）。 * 當(dāng)天配制的80%乙醇倒適量到移液槽中；用EP-300移液槍緩慢吸取200μl到 96孔板中；移動(dòng)96孔板在磁鐵中位置（來回一次，讓磁珠得到充分洗脫）。 * 重復(fù)80%的乙醇洗脫一次。注：未用完80%乙醇放回管中（不能在移液槽中暴露揮發(fā)）。 * 吸去上清液溶液后，96孔板快速離心，盡量吸去上清液溶液后，室溫晾干 8分鐘； （ ） * 用ep-100 排槍加 28μl low TE到96-孔板樣品孔中；吹打混勻；室溫（20 -25℃）5分鐘； * 放回磁鐵板，液體澄清后，用EP-100排槍轉(zhuǎn)移上清28uL到96孔板的下一排； * 吸取11 ul Mix 2到洗脫的28 uL樣品管中； * 用單槍吸取 1 uL barcode（已稀釋好的） 到相應(yīng)樣品管中；（注意：開4~6個(gè)barcod管蓋需要換一次手套，避免交叉污染�。� * 將96孔反應(yīng)板貼上蓋膜，震蕩混勻后輕微離心數(shù)秒后，將96孔反應(yīng)板置于pcr儀上反應(yīng)；反應(yīng)程序：25℃,1h；70℃，5min；4℃，hold；（注：混勻時(shí)盡量不要產(chǎn)生氣泡，若有氣泡產(chǎn)生可進(jìn)行瞬時(shí)離心消除） |
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【答案】應(yīng)助回帖
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2022年4月18日，易基因有關(guān)于：基于微量cfDNA甲基化的液體活檢如何開展的直播講座，關(guān)注“易基因”視頻號或公眾號預(yù)約看直播 內(nèi)容： 1、cfDNA甲基化介紹和臨床應(yīng)用場景 2、cfDNA甲基化檢測技術(shù)現(xiàn)狀和瓶頸 3、基于cfDNA甲基化液體活檢如何開展 4、cfDNA甲基化技術(shù)新品：cfDNA-RBS 主講人： 王君文 技術(shù)總監(jiān) 易基因合伙創(chuàng)始人 深圳市高層次人才、坪山區(qū)高層次人才 華大基因研究院表觀遺傳平臺創(chuàng)建及技術(shù)研發(fā)負(fù)責(zé)人 表觀基因組學(xué)技術(shù)專家，從事表觀遺傳學(xué)研究11年，研發(fā)創(chuàng)建LHC-BS、HMST-seq、MicroWGBS、MeDIP/ChIP-BS、cfDNA-TBS等甲基化、羥甲基化測序技術(shù)，優(yōu)化簡化基因組甲基化dRRBS、cfDNA-RBS，單細(xì)胞高通量甲基化測序、微量DNA全基因組甲基化，及RNA甲基化高通量測序等技術(shù)和方法。 申請發(fā)明專利20余項(xiàng)，授權(quán)涵蓋中國、歐盟、香港、美國等國家和地區(qū)。在《Nature》,《Nature Communications》,《Cell Research》、《Genome Biology》，《Clinical and Translational Medicine》,《Clinical Epigenetics》等國際知名期刊發(fā)表30余篇。 |
4樓2022-04-22 11:31:35
atikou
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磁珠雙篩，原理就是第一次加入的磁珠，會(huì)對大片段進(jìn)行抓取，然后上磁力架后，小片段的cfDNA會(huì)留在上清液中，這個(gè)時(shí)候，將上清液轉(zhuǎn)移出來，然后在另外加入磁珠，對這些cfDNA進(jìn)行抓取，洗脫下來的就是純凈的cfDNA了。當(dāng)然，第一步加入的磁珠的量要控制好，太多會(huì)抓取到cfDNA，太少又去除不干凈。 -----------來自深圳市易基因的回復(fù) 為助力低樣本量多維度分析，易基因開發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)的cfDNA甲基化測序方法——cfDNA-RBS，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和樣本復(fù)用，使其具有高度可擴(kuò)展性，并適用于有限的樣本和單個(gè)細(xì)胞。 |
5樓2022-06-23 22:35:39
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