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[求助]
Fosmid 文庫 構(gòu)建求助 已有1人參與
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| 最近構(gòu)建了Fosmid 文庫，且已經(jīng)篩選了兩三個(gè)月，但是一直篩不出來。因?yàn)槟康钠未蟾?0kb，我跑pcr時(shí)設(shè)計(jì)了三個(gè)不同引物，可是最后跑膠結(jié)果出來一直都是不完整的片段。請(qǐng)問有沒有對(duì) Fosmid 文庫構(gòu)建有經(jīng)驗(yàn)的師兄師姐啊，help。。。 |
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您好，謝謝回復(fù)。我的目的序列是10kb，這10kb按道理肯定包含在某個(gè)插入片段內(nèi)，因?yàn)閒osmid插入片段一般都在35-40kb。可是篩庫的時(shí)候，能跑出來?xiàng)l帶，但每次檢測(cè)后都發(fā)現(xiàn)只是我這10kb的一部分，并不是完整的10kb目的基因序列。老板想過讓直接克隆，好像直接克隆也不好弄。所以決定讓重新構(gòu)建文庫。 您的意思是提取的gDNA的質(zhì)量非常重要吧，我的載體是pEpiFOS-5。我是需要得到這個(gè)10kb的目的基因，然后做異源表達(dá)檢測(cè)產(chǎn)物。 |
3樓2017-03-22 21:51:17
2樓2017-03-22 10:45:19
【答案】應(yīng)助回帖
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篩庫能跑出條帶不代表這10kb的序列就剛好回全部在插入片段內(nèi)，也有可能是只有一部分在里面�？梢栽诤Y出克隆后，再設(shè)計(jì)其他引物進(jìn)行驗(yàn)證�；蛘咭部梢远嗪Y幾個(gè)克隆，可能其中的某一個(gè)就會(huì)包含全部的10kb序列。直接克隆的話，10kb序列太長(zhǎng)，不好弄。重新建庫的話是不是要考慮換方法呢？或者說至少要換內(nèi)切酶，因?yàn)槿绻◣旆椒ê鸵郧耙粯拥脑�，�?huì)不會(huì)仍然出現(xiàn)這種情況呢（能篩到，但得不到完整的）？ 一般這種情況，我們是設(shè)計(jì)多對(duì)引物，然后分段篩選；最后測(cè)序拼接，得到完整的目標(biāo)序列。 |
4樓2017-03-23 17:27:46
5樓2017-04-19 17:34:19
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