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笑笑12345新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
小鼠脾組織冰凍切片 已有1人參與
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各位大神，總最近在做冰凍切片，可是做出來(lái)的片子看不到細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞很松散，求大神指點(diǎn)，這是小鼠脾的組織， |
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笑笑12345
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這是我的實(shí)驗(yàn)步驟， 氣體麻醉機(jī)麻醉小鼠， 1.先用10ml的生理鹽水（預(yù)先加熱到37oC）；將老鼠，一般是30g，平放在冰塊上，從下開(kāi)始剪切，不能剪到內(nèi)臟，破胸腔，將心臟暴露，用針尖（頭皮針6號(hào)，針尖磨鈍）小心地插入左心室（尖端靠右，剪破右心室，會(huì)有血流出），剛開(kāi)始要快一點(diǎn)。，可以看到肝變白，還有肺， 2.用50ml的注射器吸10ml的PFA（平時(shí)4oC保存，要用時(shí)放入碎冰中），一共要注射3管(近30ml)。四肢抽搐，尾巴翹起來(lái)，第一管要快一點(diǎn)，但是太快血管會(huì)破裂，第二管稍微慢一點(diǎn)，第三管比第二管慢，然后再吸入空氣，注射進(jìn)老鼠體內(nèi)。此時(shí)，四肢僵硬，肝硬肺白。整個(gè)灌注過(guò)程不到10min。 3．依次剪下老鼠的內(nèi)臟，心肝脾肺腎和大腦，放入4%的PFA中，4oC保存24h-48h，固定。 沉糖 將內(nèi)臟放入冰箱保存過(guò)夜，24h以上。再用10%，20%，30%的蔗糖溶液浸泡，每一個(gè)溶液都要從漂浮浸泡到沉底才可以換下一濃度溶液。第一個(gè)濃度大概1-2h，除了肺和心，然后20%的大概過(guò)夜，。30%的會(huì)好幾天。其實(shí)在30%的時(shí)候不要這么久沉，但是有的時(shí)候來(lái)不及切片，就一直在4度冰箱30%的濃度保存。中間會(huì)換一次30%的蔗糖溶液。用的是pbs配。 然后切片時(shí)直接從蔗糖溶液中取出，用濾紙吸干，-20度包埋膠包埋，然后組織都是切大概6um，再片子放到-20度，需要時(shí)取出來(lái)染色，一般蘇木素是20min，1%的鹽酸酒精分化2-3s，然后伊紅10s。再梯度脫水封片。結(jié)果染出來(lái)的片子不好看，考多空洞，看不到細(xì)胞結(jié)構(gòu)，不知道哪一步驟除了問(wèn)題，哪位大神指導(dǎo)一下。 |
2樓2017-04-10 19:43:54
3樓2017-04-11 08:24:55
笑笑12345
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4樓2017-04-11 20:17:15
hoyeung
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5樓2017-09-26 21:02:38
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