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lff20126206新蟲 (小有名氣)
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[求助]
【求助】Ni親和層析 雜蛋白與目的蛋白一同被洗脫 已有2人參與
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如題，用BL21表達(dá)蛋白，大小120KD，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為5.68。（PS：我掃描膠的效果不好，但能說明問題就行了） 細(xì)胞破碎液過鎳柱后洗雜蛋白，并用含咪唑（50,100,150, 200, 300, 500mM）的咪唑洗脫液洗脫，總是有雜蛋白在洗脫液里。圖中beas就是鎳柱，表明我的蛋白是掛在鎳柱上了。（PS：不知道為什么，誘導(dǎo)前后看不到我的目的蛋白表達(dá)量升高，之前小量誘導(dǎo)的時(shí)候，確定該蛋白能被誘導(dǎo)。） 嘗試了用500mMNaCl洗脫（不含咪唑）雜蛋白，發(fā)洗脫中的雜帶并未改善。 請(qǐng)教各位大俠，有什么辦法可以解決這個(gè)問題？ 圖片1.png@gyesang@hc-material |
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10樓2017-04-14 08:11:16
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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50mM咪唑目的蛋白就洗脫下來了，可以考慮先用更低的咪唑梯度洗脫雜蛋白或者在破碎細(xì)胞液里加低濃度咪唑（5-20mM）減少鎳柱非特異性吸附。后面咪唑梯度洗脫不要那么細(xì)減少目的蛋白損失，再考慮用離子交換看能否去除雜蛋白。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
15樓2017-04-15 22:48:35
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2樓2017-04-13 14:45:10
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3樓2017-04-13 17:15:59
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4樓2017-04-13 17:16:28
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5樓2017-04-13 17:36:34
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6樓2017-04-13 21:46:43
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8樓2017-04-14 07:57:57
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9樓2017-04-14 08:08:50
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