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cutepigxia新蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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求助藍(lán)白斑篩選的相關(guān)問(wèn)題 已有1人參與
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我涂的板為什么會(huì)培養(yǎng)基都變藍(lán)色，而且也沒(méi)有多少白菌，挑一兩個(gè)看似白菌的菌落再劃線到新制的含氨變青霉素，x-gal，IPTG的平板上結(jié)果都又是藍(lán)色，想知道是什么原因，有木有人能給解釋一下，謝謝！ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
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17樓2017-04-19 11:32:49
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藍(lán)白斑的原理是α互補(bǔ)。JM109的LacZ基因缺少α片段，因此，不能分解x-gal顯藍(lán)色。質(zhì)粒載體上有完整的α基因序列，多克隆位點(diǎn)也在這段序列內(nèi) 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
3樓2017-04-18 11:45:33
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如果在這個(gè)位點(diǎn)插入了外源片段，將會(huì)破壞α閱讀框，這種破壞大部分情況下會(huì)造成α基因失活。如果沒(méi)有插入外源基因，α片段就可以表達(dá)，使得基因LacZ組裝完整，分解x-gal顯藍(lán)色 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
4樓2017-04-18 11:49:09
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出現(xiàn)大片的藍(lán)斑，一是可能根本沒(méi)連上外源片段，全是自連接。二是插入的片段未能使α基因失活，雖然正確插入了，卻依然是顯藍(lán)斑，這種情況一般常見(jiàn)于插入片段小于500bp，但是也有報(bào)道插入2000bp也依然無(wú)法失活α片段，顯藍(lán)色。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
5樓2017-04-18 11:52:48
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第三種，就是你用了LacZ基因完整的菌株，例如BL21，MG1655。這些菌株的LacZ基因是完整的，只要有誘導(dǎo)劑和顯色劑，就會(huì)顯藍(lán)色 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
6樓2017-04-18 11:54:45
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7樓2017-04-18 11:55:45
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排除第一種，直接不要加片段，轉(zhuǎn)化空載體，看是不是因?yàn)檩d體自連接效率太高導(dǎo)致的。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
8樓2017-04-18 11:56:48
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9樓2017-04-18 11:57:43
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看你的平板長(zhǎng)得這么濃密，載體根本沒(méi)切開(kāi)的可能性最高。換新酶，切一下就好了。切完跑一下膠，單條帶才對(duì)。沒(méi)切開(kāi)的環(huán)狀質(zhì)粒至少有兩條帶。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
10樓2017-04-18 11:59:39
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11樓2017-04-18 12:00:53
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藍(lán)色集中，可能是在平板上涂布的x-gal，應(yīng)該在倒板時(shí)，待培養(yǎng)基不燙手時(shí)，加amp，IPTG，x-gal，混勻后倒板，才會(huì)均一。另外貌似x-gal加多了，再確認(rèn)一下濃度。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
12樓2017-04-18 12:04:05
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2樓2017-04-18 10:56:52
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