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向日葵和夢(mèng)緣新蟲 (初入文壇)
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[求助]
Red大腸桿菌基因敲除卡那霉素篩選問(wèn)題 已有1人參與
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開始做Red系統(tǒng)的E. coli基因敲除，電轉(zhuǎn)后涂布卡那霉素平板（100ug/ml）沒(méi)有菌落長(zhǎng)出來(lái)。不知道是不是抗生素濃度太大的問(wèn)題。 1、第一次電轉(zhuǎn)PCR片段成功后，卡那霉素平板（50ug/ml）上長(zhǎng)出了單菌落，隨后又出現(xiàn)了很多小菌落，以為是抗生素濃度低未抑制。 2、隨后又做了好幾次感受態(tài)做電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后涂布卡那霉素平板（100ug/ml）都沒(méi)有菌落長(zhǎng)出來(lái)。 請(qǐng)教大神高手，不勝感激。 |
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junior850621
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2樓2017-05-05 20:34:09
向日葵和夢(mèng)緣
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3樓2017-05-06 08:06:19
小冀-
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 我們做的時(shí)候卡納霉素濃度是30，篩選沒(méi)有問(wèn)題，估計(jì)是你轉(zhuǎn)化的問(wèn)題，目的片段沒(méi)有導(dǎo)進(jìn)去或者導(dǎo)進(jìn)去之后沒(méi)有發(fā)生同源重組，也可能是感受態(tài)做的問(wèn)題，red系統(tǒng)表達(dá)量不夠 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
4樓2017-05-06 11:53:12
向日葵和夢(mèng)緣
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5樓2017-05-06 15:36:44
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我用的質(zhì)粒是pkd46，誘導(dǎo)劑就是阿拉伯糖，終濃度30mM，接種時(shí)直接加進(jìn)去，大概誘導(dǎo)兩個(gè)多小時(shí)至OD到0.4 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
6樓2017-05-07 09:37:07
張凡云
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應(yīng)該是感受態(tài)制備的問(wèn)題，阿拉伯糖要新鮮配置，因?yàn)檫@個(gè)的存儲(chǔ)期短，容易變構(gòu)，其實(shí)用最新的crispr cas系統(tǒng)做大腸桿菌的敲除，效率更高，個(gè)人看法而已 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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7樓2017-05-07 11:50:57
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8樓2017-05-07 16:14:09
向日葵和夢(mèng)緣
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送紅花一朵 |
接種時(shí)就加進(jìn)去阿拉伯糖呀，我都是OD為0.1時(shí)加阿拉伯糖，在誘導(dǎo)至OD為0.3，應(yīng)該是誘導(dǎo)的問(wèn)題，謝謝啦 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2017-05-07 16:17:38
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