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我是一只老年新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助，蛋白為何小樣誘導(dǎo)有條帶，大樣純化無目的條帶？ 已有1人參與
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我的目的蛋白約67.41kDa，連接載體PET32a,酶切位點為BamHI和Hind3，擴的是基因的ORF（包括終止子） 先小樣預(yù)誘導(dǎo)了，跑膠看出似乎有目的條帶 但由于小型超聲波破碎儀壞了，所以跑的樣品是全菌，無法得出目的蛋白在上清還是沉淀（圖1） 隨后，大量誘導(dǎo)后取[b上清過鎳柱后跑膠圖如下（圖2），根本沒有目的條帶，甚至雜蛋白也沒有，請大神分析一下究竟咋了 1.png 2.png |
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2樓2017-05-19 17:09:15
【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-05-25 07:44:02
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-05-25 07:44:02
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你IPTG誘導(dǎo)以后 直接拿上清做的純化嗎 你看你的目的蛋白就在沉淀里 不破碎目的蛋白不出來 直接拿iptg誘導(dǎo)后離心的上清做純化那肯定沒有啊 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2017-05-19 17:11:53
我是一只老年
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4樓2017-05-24 15:47:44
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5樓2017-05-24 23:19:53
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6樓2017-05-24 23:20:26
西西sm
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7樓2017-05-24 23:21:56
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估計你的蛋白是包涵體表達(dá)，增大體積后，蛋白表達(dá)量就很高了，更容易形成包涵體，過柱之前還是要鑒定一下的，要改進的話，降低誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)的體積也要減少。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2017-05-25 10:18:57
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可能形成了包涵體，得先破碎后離心取上清，用上清、沉淀、全菌在跑次sds，看一下你的蛋白到底在哪一層，如果不在上清，上柱當(dāng)然沒有條帶 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
9樓2017-05-25 10:35:35
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