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Catherine92金蟲 (小有名氣)
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[交流]
PCR實驗常見問題、原因分析及其解決方案 已有4人參與
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PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間，一般為48h以內(nèi)，有些最好于當日進行檢查，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。 但有時仍會與到這樣那樣的問題，影響檢測結(jié)果的判斷，具體歸類為以下常見的4點，描述如下： 問題一：無擴增產(chǎn)物 現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無  原因： 1、模板:含有抑制物，含量低 2、Buffer對樣品不合適 3、引物設(shè)計不當或者發(fā)生降解 4、反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短 對策： 1、純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量 2、更換Buffer或調(diào)整濃度 3、重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物 4、降低退火溫度、延長延伸時間 問題二：非特異性擴增 現(xiàn)象：條帶與預(yù)計的大小不一致或者非 特異性擴增帶  原因： 1、引物特異性差 2、模板或引物濃度過高 3、酶量過多 4、Mg2+濃度偏高 5、退火溫度偏低 6、循環(huán)次數(shù)過多 對策： 1、重新設(shè)計引物或者使用巢式PCR 2、適當降低模板或引物濃度 3、適當減少酶量 4、降低鎂離子濃度 5、適當提高退火溫度或使用二階段溫度法 6、減少循環(huán)次數(shù) 問題三：拖尾 現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)  原因： 1、模板不純 2、Buffer不合適 3、退火溫度偏低 4、酶量過多 5、dNTP、Mg 2+濃度偏高 6、循環(huán)次數(shù)過多 對策： 1、純化模板 2、更換Buffer 3、適當提高退火溫度 4、適量用酶 5、適當降低dNTP和鎂離子的濃度 6、減少循環(huán)次數(shù) 問題四：假陽性 現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物 原因： 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 對策： 1、操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外； 2、除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。 3、各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存 |
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2樓2017-07-04 18:28:25
3樓2017-07-16 15:41:06
4樓2017-11-12 16:08:32
principle616
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
5樓2017-11-17 09:02:18
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