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Catherine92

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專業(yè): 生物化學

[交流] 實驗室建設——臨床分子病理基因檢測實驗室

近年二代基因測序（next-generation sequencing，NGS）技術快速發(fā)展，其應用已進展至臨床檢測，如遺傳疾病、實體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細胞抗原分析及非侵襲性產前篩查等。

一、實驗室總體要求

NGS檢測實驗室的總體設計與要求應參考《分子病理診斷實驗室建設指南（試行）》、《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》、《個體化醫(yī)學檢測質量保證指南》、《腫瘤個體化治療檢測技術指南》、《個體化醫(yī)學檢測實驗室管理辦法》、《測序技術的個體化醫(yī)學檢測應用技術指南（試行）》進行。

1.NGS檢測人員的資質要求：
應具備臨床病理學、分子生物學的相關專業(yè)大專以上學歷，并經過NGS技術的理論與技能培訓合格。數據分析人員應具有臨床醫(yī)學或分子生物學或遺傳學知識背景并經生物信息學培訓。最終報告應由中級或碩士以上具有病理學背景、經培訓合格的本單位執(zhí)業(yè)醫(yī)師或者授權簽字人（醫(yī)學博士學位或高級職稱）審核。

2.NGS檢測實驗室的區(qū)域設置要求：
原則上NGS實驗室應當有以下分區(qū)：
樣本前處理區(qū)、
試劑儲存和準備區(qū)、
樣本制備區(qū)、
文庫制備區(qū)、
雜交捕獲區(qū)/多重PCR區(qū)域（第一擴增區(qū)）、
文庫擴增區(qū)（第二擴增區(qū)）、
文庫檢測與質控區(qū)、
測序區(qū)、
數據存貯區(qū)。
各工作區(qū)空氣及人員流向需要嚴格按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》。分區(qū)可根據實際情況合并，但是在前處理和建庫時，血液樣本應與組織樣本分開。

3.NGS檢測試劑及項目要求：
試劑和測序平臺均應選擇中國食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）認可產品。涉及到實驗室自配試劑，應該有嚴格的試劑制備標準操作規(guī)程（SOP），需經過臨床實驗室自建項目（LDT）驗證合格才可使用。每個NGS檢測項目在驗證時需要根據建庫方法、測序平臺和分析工具以及不同的突變類型包括，單堿基突變single nucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels）、基因拷貝數變異Copynumber variations（CNVs）、染色體結構變異，structuralvariation（SVs）以及不同的樣本類型（如FFPE組織、新鮮組織、全血、胸水等）對特定panel的準確性、精確性、敏感性、特異性等性能參數進行LDT驗證。應該有經過標準品測試的在不同的mutant allele frequencies（MAF）下，不同測序深度的靈敏度及特異性數據，確定不同樣本的可信的測序深度。經驗證后，SOP發(fā)生的任何改動，包括試劑、儀器、基因項目等都需要重新做驗證。驗證實驗結果簽名留底備案。

4.NGS檢測實驗室的質量管理要求：
NGS檢測主要包括實驗操作和生物信息學分析兩部分。
實驗操作部分包括樣本準備、文庫制備、編碼（barcoding）、目標區(qū)域富集、測序等；
生物信息學分析部分包括定位（mapping）、比對、變異識別、變異注釋、變異解讀及報告等。
上述流程均需要建立實驗室質量管理體系文件和SOP及機器運行和維護SOP，具有嚴格的室內質控措施；定期參加室間質評以有及持續(xù)的質量保證和改進計劃。

二、NGS檢測流程中的質量標準

1.核酸提取及其質量分析：
提取的核酸質量是NGS檢測成功的關鍵因素，在制備文庫前應采用多種方法對核酸質量評估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據不同的樣本類型制定相應的SOP用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對應明確接受和拒絕的標準。

2.文庫制備及其質量分析：
文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴增子建庫，無論采用何種方法制備文庫和平臺檢測，都應對檢測基因、區(qū)域或突變熱點進行描述，并建立實驗室檢測SOP。建立好文庫后上機測序前需對文庫進行質量分析。每個檢測項目應設定其文庫質量的要求，明確接受或拒絕的標準。

3.NGS測序儀上機分析及其質量分析：
NGS建庫主要有擴增法和捕獲法兩大策略，測序時根據檢測樣本量和質量要求確定適當的芯片，以保證測序質量和靶區(qū)覆蓋深度。錄入樣本編號、檢測內容、設定參數等信息，按儀器操作流程進行測序。產生的測序數據質量參數要求詳見后文。

4.NGS檢測中的樣本追蹤及對照設置：
（1）樣本追蹤：為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個SNV位點或其他標簽作為樣本身份標識（sample ID），在檢測前對每個樣本進行SNV位點信息的測定，在NGS檢測后對上述位點進行追蹤，證明沒有交叉污染。
（2）陽性對照：應用組合型質控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復雜性。實驗時同時檢測，以確保其檢出能力。
（3）陰性對照：用無核酸或明確無突變的樣本作為模板同時進行檢測，以確保檢測過程中沒有污染或非特異性。
（4）應對方案和替代方法：各個質量控制步驟中如出現異�；蚴�，實驗室應有應對措施或備選方案；對于測序結果質量差或有問題的區(qū)域應建立替代方法（如Sanger測序）。

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1樓 2017-06-16 13:58:41

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