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淺談蛋白純化及制備過程中沉淀的形成
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Sample Text 蛋白發(fā)生沉淀的本質(zhì) 1.蛋白質(zhì)的水化膜遭到破壞或者中和了表面的凈電荷后形成的沉淀往往是可逆的，這在蛋白鹽析,蛋白等電沉淀中最為常見,利用這一特性也常用來純化分離蛋白。 2.蛋白分子在遭到劇烈的物理化學(xué)(如高溫,極端pH等)作用時(shí)，分子中的次級(jí)鍵遭到破壞斷裂，導(dǎo)致空間構(gòu)象從緊密有序的變?yōu)樗缮o序的狀態(tài),這種清況下形成的沉淀是不可逆的，蛋白發(fā)生變性。 對蛋白的生物活性進(jìn)行檢測即可判斷是否可逆性沉淀 1.蛋白自身性質(zhì) 如膜蛋白及一些疏水性高的蛋白就很容易發(fā)生疏水聚合而沉淀。這從我們做膜蛋白提取以及包涵體溶解時(shí)都有切身體會(huì)。 在表達(dá)還有二硫鍵鍵的蛋白時(shí)特別容易形成包涵體蛋白。所以蛋白的氨基酸序列中，含硫氨基酸較多時(shí)也容易形成沉淀。 2.pH值 蛋白質(zhì)大多數(shù)都在高pH時(shí)溶解性高，低pH時(shí)易沉淀。這可能與氫鍵的形成有關(guān)。但有時(shí)候更低pH時(shí)蛋白又溶解了。這一現(xiàn)象在我們用親和層析純化抗體時(shí)特別常見。 3.鹽濃度 就是鹽析效應(yīng)。高濃度的鹽破壞蛋白的水化層，使得蛋白質(zhì)聚集沉淀。常用的就是硫酸銨沉淀。鹽析沉淀通常對蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)沒有破壞，再溶時(shí)活性可以完全恢復(fù)。常見的例子就是硫酸銨沉淀純化IgG。同樣，硫酸銨沉淀也常碰到不可逆的情況。例如大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)的重組蛋白往往在硫酸銨沉淀后再溶困難。 4.有機(jī)溶劑 例子有丙酮沉淀。但有機(jī)溶劑也不是全部對蛋白起沉淀作用，有時(shí)候也有助溶作用。例如有些膜蛋白的有機(jī)溶劑抽提。 5.溫度 高溫或低溫都有可能使得蛋白質(zhì)沉淀。煮沸沉淀常見了，低溫沉淀的例子有血液制品的冷乙醇沉淀。 6.表面活性劑 對蛋白質(zhì)有助溶作用。例如做電泳的SDS就是很強(qiáng)的表面活性劑。還有TWEEN，Triton等等。 7.還原劑 還原劑往往對蛋白質(zhì)有助溶作用。有些蛋白當(dāng)加入的還原劑在空氣中慢慢氧化后，就會(huì)沉淀析出。 8.變性劑 如尿素、鹽酸胍。包涵體蛋白在用變性劑溶解后，再去除變性劑經(jīng)常會(huì)沉淀析出。 利用可逆沉淀純化蛋白 1.在蛋白質(zhì)水溶液中，加入了高濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等而使蛋白質(zhì)從溶液中析出，稱為鹽析。 2.在確定蛋白的pI后，用弱酸/弱堿（如碳酸鈉等）緩慢滴加到蛋白溶液中，使溶液pH和pI一致，即可沉淀出目標(biāo)蛋白，稱為等電沉淀。 避免不可逆沉底的發(fā)生 1.對溫度敏感型蛋白的純化制備盡可能在4度的環(huán)境中進(jìn)行。 2.蛋白溶液在透析脫鹽時(shí)盡可能的避免體系劇烈變化，可梯度透析。 3.親和層析純化蛋白時(shí)，大學(xué)需要較低的pH洗脫，在收集洗脫峰的容器中墊緩沖液，讓洗脫下來的蛋白迅速恢復(fù)到中性環(huán)境。 4.總而言之，在蛋白純化及制備過程中，選擇溫和的操作環(huán)境，換緩沖液等過程要緩慢，避免劇烈操作。另外在制備過程中也可以嘗試加一些增溶劑，尿素，精氨酸等。也可嘗試加還原劑DTT，B-ME等。也可以加EDTA避免蛋白的降解。 處理沉淀 1.發(fā)生可逆沉淀后，我們可以嘗試通過增加溶劑，調(diào)節(jié)pH，添加助溶劑等方式來處理。 2.若發(fā)生不可逆沉淀，可以選擇離心，過濾等方式去除。 生物制藥合伙人（齊聚力量，助力發(fā)展） 歡迎留言批評指正并分享您寶貴的經(jīng)驗(yàn)，謝謝�。� 55.jpg |
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