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youngsun50木蟲 (正式寫手)
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[求助]
用質(zhì)粒做real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，效果差。求助！ 已有2人參與
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各位蟲友，我用real-time PCR做Albumin的標(biāo)準(zhǔn)曲線，是用克隆了albumin序列的重組質(zhì)粒做逐級10倍稀釋（10^6 到10^0拷貝）。之前做過好多次，效果都很好，定量范圍（即兩個10倍稀釋點(diǎn)之間的△Ct：2.6~4.0；復(fù)孔的△Ct<1.5）能夠到10個拷貝。我3月1日做還是可以的，到3月15日再做，就開始變差了，這兩次的條件包括質(zhì)粒和試劑都沒變。最近多次做的效果都能差，一些10倍稀釋點(diǎn)之間的△Ct都>4.0，有時候有的點(diǎn)的復(fù)孔△Ct也>1.5。 我嘗試過消除可能的原因，包括把引物和探針都新合成，質(zhì)粒重新克隆并提取，換其他牌子的PCR mastermix， 結(jié)果都沒有改善。 請給予建議或分析可能的原因，謝謝！  |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
youngsun50: 金幣+2, ★有幫助 2017-07-26 18:08:22
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2017-08-30 07:44:53
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1、一般情況，三個點(diǎn)都太少，一般還是要5個可以統(tǒng)計(jì)分析的點(diǎn)，而且最少也要做2個重復(fù)，否則，你的結(jié)果很有可能是一種偶然現(xiàn)象，一般R值要達(dá)到0.98才行。 2、進(jìn)行相對定量不做標(biāo)準(zhǔn)曲線,不計(jì)算擴(kuò)增效率而直接應(yīng)用DeltaDelt CT法是不科學(xué)的!想必樓主是想用DeltaDelt CT法了,這個方法應(yīng)用的前提是目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致,試問你如果不做標(biāo)準(zhǔn)曲線又如何知道目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率?也就更談不上要擴(kuò)增效率一致了. 3、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,樓主可直接將樣品稀釋成一定的濃度梯度,直接進(jìn)行擴(kuò)增,最后一定要保證有5個濃度可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,而且至少重復(fù)一次.如果結(jié)果理想,目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率一致,那你就可以直接應(yīng)用DeltaDelt CT法了,對另外幾個處理進(jìn)行定量的時候就沒有必要再做標(biāo)準(zhǔn)曲線了. 4、一般說來,目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相差3個百分點(diǎn)都可以認(rèn)為效率是一致的! |
2樓2017-07-26 16:34:37
youngsun50
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
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- 專業(yè): 系統(tǒng)生物學(xué)
逐條回復(fù)你的評論3樓2017-07-26 17:14:44
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4樓2017-08-17 22:08:33
5樓2017-08-29 21:16:15
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