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小木蟲論壇-學術(shù)科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 核酸提取 » 過柱法提蛋白
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bio轉(zhuǎn)錄組金蟲 (正式寫手)
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[求助]
過柱法提蛋白
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想直接從卵中提取蛋白，但是操作不熟悉，想請教一下相關(guān)大神，指導一下。 從卵勻漿中提蛋白，使用manman-agarose過柱法。 想咨詢一下主要步驟和透析袋的使用方法。  |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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Ni柱中的氯化鎳可以與有HIs（組蛋白）標簽的蛋白結(jié)合,也可以與咪唑結(jié)合. 步驟是：過柱子前可以選擇Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化鎳,一個柱長體積就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,給蛋白提供最適的環(huán)境,我一般平衡4個柱長,然后蛋白上樣,你可以讓他自己掛,這樣掛柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加個恒流泵,但是一定不能太快,太快掛柱效果差,當然你也可以選擇循環(huán)掛柱,就是恒流泵的一頭接你裝蛋白的燒杯,從柱子中留下來的液體還用同一個燒杯接回去.掛完之后,按理想來講,你的蛋白在Ni柱中與Ni就結(jié)合了,雜蛋白多數(shù)在燒杯里,留下來了,當然肯定有少量雜蛋白也掛上了,這時候你要梯度洗脫,拿咪唑和你的buffer配,一般從0 20mM 40mM.100mM這樣洗脫（當你不知道你的蛋白大概在什么時候出來的時候）我指的是咪唑的終濃度.咪唑加入之后,會和蛋白爭奪與Ni的結(jié)合位點,雜蛋白、你的目的蛋白,會在不同的濃度被洗脫下來,洗完之后,你可以用200mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡幾次,是否選擇重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~ 過的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page檢測在哪個管子里. |
2樓2017-07-29 17:12:49
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3樓2017-08-18 21:09:47
bio轉(zhuǎn)錄組
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 48 (小學生)
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- 專業(yè): 動物遺傳學
4樓2017-08-29 10:53:01
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