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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » 如何設計簡并引物？
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[求助]
如何設計簡并引物？ 已有1人參與
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如題，有人會用primer或是codehop設計簡并引物嗎？求大神幫忙！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
cheny21: 金幣+10, ★★★很有幫助 2017-08-04 20:00:25
感謝參與，應助指數(shù) +1
cheny21: 金幣+10, ★★★很有幫助 2017-08-04 20:00:25
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這讓我想起兩年前因為需要獲得幾個家族的未知序列特異基因而學習利用codehop方法設計簡并引物的經(jīng)歷。當時，通過常規(guī)方法設計出來的簡并引物擴增效率極低，而且特異性非常差，為此糾結了好一段時間。后來從一同事那里得知設計簡并引物可以利用codehop方法，但是他對該方法也只是聽說沒有用過，所以我只能自己在網(wǎng)上查找資料并且試圖詢問有經(jīng)驗的朋友的幫助。除了找到幾篇經(jīng)典文獻，在網(wǎng)上尋求幫助幾乎沒有什么信息。也許是因為用過該方法的人比較少，多數(shù)帖子只是看到有人在討論，但是沒有使用經(jīng)驗。 通過我的經(jīng)驗，感覺codehop方法設計簡并引物的確有它的優(yōu)點可實用性。今天又看到有人求助，所以索性把自己的經(jīng)驗說一說，讓更多需要的朋友能夠從中獲益。 首先我想說codehop本身是一種簡并引物設計 理論方法(COnsensus DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers )。傳統(tǒng)簡并引物設計 方法通常簡并度過高，導致有效引物利用率低，減小簡并引物長度獲得小簡并度的同時又降低了退火溫度 ，不利于擴增。利用codehop方法設計簡并引物與傳統(tǒng)方法比較應該具有更高的擴增特異性和靈敏度等優(yōu)點。Codehop方法的原理是設計的簡并引物包括兩個部分，一部分利用序列比對中得到的保守區(qū)內連續(xù)保守的3-4個氨基酸序列(9-12個堿基)設計得到3’簡并核心區(qū);另一部分是根據(jù)根據(jù)保守氨基酸和密碼子偏好性原則預測得到最佳配對的5’非簡并夾板區(qū)。設計過程中利用減小3’簡并核心區(qū)的長度可以減少簡并引物中簡并堿基的使用量，擴增過程中，5‘非簡并夾板區(qū)可以很好的穩(wěn)定3’簡并核心區(qū)與模板的結合，從而很大程度上提高了擴增的特異性，而且利用加長5’非簡并夾板區(qū)序列可以提高引物退火溫度 同時不增加簡并度。盡管初輪擴增中5‘特異區(qū)可能與模板序列發(fā)生錯配，但是3’核心區(qū)的不匹配會使引物在延伸過程中失效，幾輪擴增后引物特異性匹配會大幅增加，以此提高特異性和準確率。 藉此理論依據(jù)，在利用CODEHOP方法設計簡并引物時。 一，利用NCBI 搜索不同物種 中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列。由于密碼子偏好性差異，不同的核酸序列可能表達出相同的氨基酸序列，而氨基酸序列才具有真正的保守性。在這一過程中，如果目的基因來源于單一物種 ，最好搜索相應的親緣或同源物種的蛋白序列。 二，將找到的氨基酸序列進行多序列比對，有很多工具軟件 可以進行這一工作，個人推薦在線工具ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。 三，利用多序列比對找到基因保守區(qū)后，需要選取合適的區(qū)域來設計引物。因為codehop方法要求引物有兩個部分，3‘核心區(qū)長度應為11-12個堿基，5’夾板區(qū)要求18-25個堿基。也就是說我們應該在基因上下游各找到一個保守區(qū)域至少有4個連續(xù)保守的氨基酸位點作為3‘核心區(qū)，而且在這4個保守位點附近其他7個氨基酸位點應該也具有一定保守度，作為引物的5’夾板區(qū)。 四，選取好保守區(qū)后，就可以開始著手設計引物。首先針對所選取的氨基酸保守序列，將其翻譯成核苷酸 序列，在翻譯時參照相應的密碼子偏好表(推薦密碼子偏好性數(shù)據(jù)庫：http://www.kazusa.or.jp/codon/)找到目的基因的來源物種的密碼子偏好。同時為了更精確，可以把多序列比對中來源于其他親緣或同源物種的氨基酸序列的核酸編碼序列找到，并做比對，以此更加確定引物3‘核心區(qū)序列。當確定了引物的3’核心區(qū)后，開始在這個核心區(qū)對應的5’端上游序列上利用同樣的方法選取氨基酸位點，翻譯成核苷酸 序列，不同的是，這個區(qū)域翻譯過程中遇到不確定的堿基編碼可以進行相應簡并。需要注意的是，3‘端設計時結束核苷酸應為編碼相應氨基酸的三聯(lián)密碼子的更為保守的第一位或第二位，以在擴增中順利延伸。另外，5’夾板區(qū)也應盡可能減少簡并度，以提高擴增特異性。 五，設計結束，檢查引物簡并度，盡量控制在低范圍內。檢查引物退火溫度，應適當高一些，以便必要時利用touchdown PCR 提高特異性產(chǎn)物量�；蚋鶕�(jù)自己所需對引物進行其他修飾。 以上是根據(jù)個人經(jīng)驗總結的CODEHOP簡并性引物設計方法�；痉椒ㄊ沁@樣的，每個人在實際應用中根據(jù)自己不同需要可以靈活運用。 另外，有必要說一下的是，CODEHOP引物設計方法有自己在線的引物設計工具：iCODEHOP目前為v1.0版本(https://icodehop.cphi. ... ntext/Welcome ， 2011年4月1日后將啟用新地址： http://purl.org/net/icodehop)。 我個人使用經(jīng)驗來看，這個設計工具比較適合初用上手，但是如果對引物有特殊要求或者要求更加適合特定物種基因，最好還是將該在線工具結合人工核對，這樣效率更高，準確度更好。 |
2樓2017-08-04 18:46:29
3樓2017-08-04 20:01:45
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