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Dream阿貍ALi新蟲(chóng) (初入文壇)
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濕轉(zhuǎn)和干轉(zhuǎn)，哪個(gè)方法更好
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對(duì)于一個(gè)完美的westernblot實(shí)驗(yàn)，蛋白在聚丙烯凝膠中根據(jù)天然分子量進(jìn)行分離，蛋白被很好的從凝膠上轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后通過(guò)特異性的抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)。 對(duì)于轉(zhuǎn)印來(lái)說(shuō)，使用濕轉(zhuǎn)的方法是比較好的，因?yàn)槟z和膜都能夠完全浸沒(méi)在轉(zhuǎn)印buffer中，在半干轉(zhuǎn)的條件下，轉(zhuǎn)印是在兩個(gè)電極板之間發(fā)生，這種類(lèi)型的轉(zhuǎn)印裝置可能影響蛋白的轉(zhuǎn)印效率和膜上的截留能力。對(duì)于優(yōu)化蛋白的轉(zhuǎn)印條件，每個(gè)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)都應(yīng)該考慮進(jìn)去。 濕轉(zhuǎn) 對(duì)于一個(gè)濕轉(zhuǎn)過(guò)程，要建立一個(gè)三明治結(jié)構(gòu)，順序?yàn)楹＞d，濾紙，膜，膠，濾紙，和第二個(gè)海綿。在組裝之前，需要將所有部分（包括膠）放在轉(zhuǎn)印buffer中進(jìn)行平衡，然后將堆疊的三明治結(jié)構(gòu)用轉(zhuǎn)印夾夾起來(lái)放在轉(zhuǎn)印裝置上，連上電極裝置，蛋白在轉(zhuǎn)印buffer中從膠上轉(zhuǎn)移到膜上。大多數(shù)western blot實(shí)驗(yàn)應(yīng)用都可以使用濕轉(zhuǎn)。 半干轉(zhuǎn) 對(duì)于半干轉(zhuǎn)來(lái)說(shuō)，也需要進(jìn)行堆疊組裝（濾紙，膠，膜需要放在轉(zhuǎn)印buffer中進(jìn)行預(yù)平衡）放在裝置電極板的底部，蓋上上極板，高強(qiáng)的電流通過(guò)三明治結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)印速度較快，一般小于1h。 轉(zhuǎn)印的注意事項(xiàng) 1.當(dāng)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)印buffer時(shí)一定要注意：小組分的不一致都可能影響轉(zhuǎn)印 2.使用高質(zhì)量，純度高的甲醇溶液，如果甲醇質(zhì)量不佳，會(huì)影響轉(zhuǎn)膜的效率 3.不要稀釋轉(zhuǎn)印buffer 4.不要調(diào)整轉(zhuǎn)印buffer的PH值 5.為了得到最佳的轉(zhuǎn)印，buffer要使用新的 6.裝置保持干凈 7.使用一定厚度的膠（0.5-0.75） 8.如果使用PVDF膜，膜在轉(zhuǎn)印之前需要在100%甲醇中進(jìn)行浸泡 9.轉(zhuǎn)印墊，濾紙，膠和膜需要在轉(zhuǎn)印buffer中平衡至少15min 10.在轉(zhuǎn)印的時(shí)候要將膜和膠之間的空泡趕走 11.確定電極是連接正確，避免不必要的損失 12.使用預(yù)染的分子量marker，來(lái)監(jiān)控轉(zhuǎn)印 13.對(duì)于難轉(zhuǎn)印的蛋白，可以調(diào)整甲醇和SDS的濃度，SDS能夠提升蛋白從膠上的遷移而抑制與膜的結(jié)合。甲醇能夠促進(jìn)蛋白和膜的結(jié)合，但是阻礙蛋白從膠上的遷移。 圖片1.jpg 圖片2.jpg 圖片4.jpg 圖片3.jpg |
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2017-08-25 17:10:18, 205.67 K
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