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質(zhì)粒圖譜之火眼金睛是如何煉成的？ 已有2人參與
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質(zhì)粒和載體傻傻分不清楚 質(zhì)粒(Plasmid)是附加到細(xì)胞中的非細(xì)胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子(即細(xì)胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構(gòu)型。 載體即要把一個(gè)有用的基因（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過(guò)基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（vector）。細(xì)菌或病毒質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。 簡(jiǎn)而言之，質(zhì)�？梢哉f(shuō)是一個(gè)統(tǒng)稱(chēng)，載體是質(zhì)粒改造過(guò)用來(lái)運(yùn)載的工具 選用質(zhì)粒做載體的要求 以最常用的為例 （1）選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）； （2）一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般 10 個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10 個(gè)。 （3）必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地； （4）必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr。 無(wú)論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進(jìn)行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。 如何一眼看穿質(zhì)粒圖譜 ① 復(fù)制起始位點(diǎn)Ori，了解質(zhì)粒的類(lèi)型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒），Ori的箭頭指復(fù)制方向，其他元件標(biāo)注的箭頭多指轉(zhuǎn)錄方向（正向）。 ② 再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記： Ampr：水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。 tetr ：可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。 camr：生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。 neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 hygr：使潮霉素β失活。 ③ 看多克隆位點(diǎn)（MCS）：它具有多個(gè)限制內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)（質(zhì)粒上只能有該內(nèi)切酶的唯一酶切序列，不然就一刀好幾段了），便于咱們要研究的基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選，最常見(jiàn)的是β-半乳糖苷酶的藍(lán)白斑篩選系統(tǒng)。 ④再看外源DNA插入片段大�。嘿|(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來(lái)說(shuō)，外源DNA片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。 ⑤ 是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子（promoter）－核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)（AATAAA同時(shí)是poly A）。這是用來(lái)區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體�？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。 ⑥看報(bào)告基因：主要是為了能迅速檢查功能基因是否表達(dá)的陽(yáng)性判斷，表達(dá)成功的蛋白在小鼠體內(nèi)分布位置。 ⑦看質(zhì)粒圖譜上的箭頭：它代表DNA兩條鏈（正義鏈和反義鏈），即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA，它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。 目的基因片段進(jìn)行連接。 注意：不管從哪個(gè)途徑得到的質(zhì)粒載體，拿到之后一定要去測(cè)序公司測(cè)個(gè)序，驗(yàn)證該質(zhì)粒的真?zhèn)位蛘呤欠裼型蛔儯匍_(kāi)始做實(shí)驗(yàn)。 |
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2樓2018-02-24 06:12:54
haluonihao
銀蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 428
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- 在線: 19.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1157389
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- 專(zhuān)業(yè): 骨、關(guān)節(jié)、軟組織醫(yī)用材料
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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買(mǎi)的質(zhì)粒需要測(cè)序，想請(qǐng)問(wèn)下需要測(cè)全長(zhǎng)嗎？或者怎么選測(cè)序的部分？謝謝 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
3樓2018-05-08 07:32:05
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