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餓的神啊新蟲 (著名寫手)
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[求助]
體外轉(zhuǎn)錄 已有1人參與
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| 想要體外轉(zhuǎn)錄dsRNA，已經(jīng)在上下游引物的5'端都加了T7啟動(dòng)子序列，但是膠回收得率很低，只有大概40ng/ul，遠(yuǎn)達(dá)不到體外轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的起始模板量，所以想將PCR產(chǎn)物克隆到帶T7啟動(dòng)子的載體上，比如pEASY-T1-simple，現(xiàn)在問題是這類的載體的T7啟動(dòng)子離插入片段都至少有幾十bp的距離，我想問這幾十bp的非目的片段是否會(huì)影響體外轉(zhuǎn)錄后生成的dsRNA，急求 |
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kangaroo0513
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
餓的神啊: 金幣+20, ★★★很有幫助 2017-09-21 17:20:09
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私覺得，后面有一串也沒有太大問題，否則就沒有神馬載體可以用于轉(zhuǎn)錄了。 濃度低兩個(gè)辦法 1. 多切載體，多回收，回收的時(shí)候如果片段小于350bp，就在溶膠之后上柱之前加1/3體積的異丙醇。 2. 把你的目的片段放到載體里之后，用高保真酶進(jìn)行PCR，然后揮手PCR產(chǎn)物，用于體外轉(zhuǎn)錄。 |
2樓2017-09-15 13:17:26
餓的神啊
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3樓2017-09-15 14:48:44
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4樓2017-09-15 14:48:59
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5樓2017-09-15 16:46:09
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6樓2017-09-15 21:11:37
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7樓2017-11-19 18:30:46
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