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求助，PCR純化產(chǎn)物分光光度計與電泳結(jié)果不符 已有2人參與
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本人實驗新人一枚，現(xiàn)在做的是PCR后內(nèi)切來驗證基因多態(tài)性，最近遇到了一個難以解決的問題。 本人現(xiàn)在現(xiàn)在用的是天跟的PCR MIX，然后用的是omega的純化試劑，現(xiàn)在遇到的問題是：我純化后的PCR產(chǎn)物（只有244bp），在酶標儀、分光光度計檢測下濃度相差不大，都是50ul的PCR體系中可以提取出體積35ul，濃度約50-60ng/UL的，純度1.8-2.0之間純化液，但是電泳看不到除了MARKER之外的條帶（圖一），即使我加DNA總量達到了幾百ng，仍然是什么都看不見，但是似乎隱約有點條帶，聯(lián)系OMEGA的技術(shù)后考慮其實并沒有回收那么多的DNA，建議我加用異丙醇，但是我加了幾百ng都看不見，我覺得加用異丙醇意義不是特別大，而且我是要做內(nèi)切酶的，對DNA是有要求的（1ug），如果他們的試劑真的存在干擾濃度測定的話，接下來內(nèi)切我也不好做，所以來求助一下各位大神，是否實驗還有所改進，還是更換一些能更好提取小分子DNA的試劑。 PS：我做了引物濃度（華大基因）、模板DNA濃度、Tm的梯度，發(fā)現(xiàn)我的模板DNA需要加到幾百ng，引物濃度需要加到1.6uM，才能得到比較清晰的條帶，但是引物二聚體（40bp）在瓊脂糖上一直很明顯（圖二，目的條帶看起來不明顯的原因是手機沒拍好），PCR的純化產(chǎn)物也應(yīng)該是目的條帶，因為我在不同引物濃度下的PCR，引物二聚體的條帶亮度差別較大，但是純化產(chǎn)物在酶標儀、分光光度計檢測下濃度相差不大，所以應(yīng)該是產(chǎn)物濃度。現(xiàn)在也是一籌莫展，懇請各位大神指點。 我之前好像也在丁香園看到過說是部分試劑存在這種情況，不知道各位大神有何指點。 圖一1.jpg 圖二.jpg |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-09-29 07:50:01
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-09-29 07:50:01
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膠回收試劑盒可能過期了，還有個原因是pcr產(chǎn)量本身就不多，沒有條帶只能重新擴增了，換個回收試劑盒，回收錢跑一兩微電泳看一下條帶大小 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2017-09-19 12:53:04
3樓2017-09-19 16:49:03
4樓2017-09-20 15:41:36
yubeihong
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5樓2017-09-28 18:46:32
6樓2017-09-28 19:40:25
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