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小小小小小小柔新蟲 (初入文壇)
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[求助]
T4 DNA連接酶怎么提高連接效率 已有2人參與
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我用T4 DNA 連接酶連接磷酸化以后的5'和3'的羥基，請(qǐng)問怎么提高連接效率。我用的條件是25℃過夜，酶濃度是DNA濃度的10倍，求大神指點(diǎn) 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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以T4連接酶進(jìn)行連接的方法，這兩種方法轉(zhuǎn)化子比較多，陽性率也不錯(cuò)，唯一的不足就是連接的時(shí)間長(zhǎng)。因?yàn)檫B接時(shí)間越長(zhǎng)效率越高，一般快速連接方法需要半個(gè)小時(shí)到一個(gè)小時(shí)；達(dá)到最佳的效果，要過夜連接。 以拓?fù)洚悩?gòu)酶（TOPO）進(jìn)行連接的方法，這種方法的優(yōu)勢(shì)是快速連接，在5-15分鐘就可以將目的基因克隆到載體中，陽性率比較高，這種方法國(guó)內(nèi)也有人模仿。這種方法雖然速度快，但是也有一些缺陷，比如長(zhǎng)片段連接效率不如T4連接酶，轉(zhuǎn)化子少，TOPO酶對(duì)溫度很敏感，穩(wěn)定性較差。 |
2樓2017-10-09 21:19:53
didongwei
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3樓2017-10-09 22:56:31
小小小小小小柔
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4樓2017-10-11 10:33:20
didongwei
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solutionI本身就含有連接酶，且buffer不一樣，連接效率就有很大差別，有些稀有酶切位點(diǎn)連接效率低，可以試試這個(gè)方法，我之前換過后，連接成功了 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
5樓2017-10-11 10:39:33
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但是我的目的是要測(cè)酶活性呀 換了怎么測(cè)  我還想問一下 你們做連接反應(yīng)的時(shí)候里面有加一價(jià)的陽離子嗎（比如 鈉離子，鉀離子）發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2017-10-11 12:13:41
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