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風(fēng)鈴。新蟲 (初入文壇)
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[求助]
TA克隆和TOPO克隆和Gateway克隆原理他們之間不同點(diǎn)... 已有1人參與
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TA克隆和TOPO克隆和Gateway克隆原理他們之間不同點(diǎn)有哪些？謝謝啦 @youlinglyw 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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Gateway®克隆技術(shù)的基礎(chǔ)是lambda噬菌體的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)，一種準(zhǔn)確保存遺傳信息的有效的自然的生化途徑。與傳統(tǒng)的需要DNA限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、凝膠電泳和DNA片段純化等多個(gè)步驟的單調(diào)乏味的亞克隆方法相比，該方法只需一步生化反應(yīng)而且操作方便、快捷(室溫60分鐘)，節(jié)省了大量的時(shí)間和勞力。另外，根據(jù)目的蛋白的生產(chǎn)和純化的不同要求， Invitrogen公司提供一系列含有不同啟動(dòng)子和融合標(biāo)簽、以及在幾種宿主表達(dá)的目標(biāo)載體。 TA克隆技術(shù)（TA cloning）利用Taq聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）活性，但卻不具有3'-5'端外切酶校準(zhǔn)活性的特點(diǎn)，可在PCR產(chǎn)物的3'端加上一個(gè)非模板依賴堿基“A”。pMD18-T是一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體，它是由pUC18載體在Xba I和Sal I識(shí)別位點(diǎn)間插入一個(gè)EcoR V位點(diǎn)，然后用EcoR V進(jìn)行酶切使質(zhì)粒線性化，并在它的3'端添加“T”構(gòu)建而成。因其3'端帶有一個(gè)突出的“T”尾，能高效地與帶“A”尾的PCR產(chǎn)物連接，極大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR產(chǎn)物最簡便、快捷的方法。 TOPO克隆的核心是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，它同時(shí)扮演了限制性內(nèi)切酶和連接酶兩個(gè)角色。它的生物功能是在復(fù)制過程中切斷并重新連接DNA。牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I特異性地識(shí)別5’-(C/T)CCTT-3’序列，與3’T的磷酸基團(tuán)形成共價(jià)鍵，并切斷一條DNA鏈，使DNA解鏈。隨后它從DNA末端撤離。為了利用拓?fù)洚悩?gòu)酶的連接活性，TOPO載體被線性化，并在每個(gè)3’磷酸基團(tuán)上連接了拓?fù)洚悩?gòu)酶I�；具^程與TA克隆相似，注意事項(xiàng)可以參考TA克隆的策略。唯一不同的是連接過程。 |
2樓2017-10-13 08:31:28
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