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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 蛋白電泳/WB » WB常見問題分析
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WB常見問題分析 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB )是很常規(guī)的生物學實驗，是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測的方法。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。 嗯，聽起來不錯，不過真正在實驗室里做實驗的小伙伴恐怕都遇到過各種實驗結(jié)果不完美的狀況，做了很久的WB，走了很多彎路，但是WB想要做好并不難，總結(jié)WB實驗中可能會遇到的問題，分析可能的原因及對應的解決方案，這就是實驗成功的基石。下面我們列舉一些常見問題一個個分析。 1．膠片是一片空白，是怎么回事？ 答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。 1）二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光； 2）ECL底物中H2O2不穩(wěn)定，失活； 3）ECL底物沒覆蓋到相應位置； 4）一抗選擇不當； 5） 二抗失活。 2．背景高咋回事？ 答：可能的原因有： • 1）膜沒有完全均勻濕透,建議 使用100% methanol浸透膜； • 2）洗膜不充分，可以增加洗液體積和洗滌次數(shù)； • 3）電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調(diào)整電極和加樣； • 4）封閉物用量不足，可以提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜； • 5）封閉物使用不當，比如檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉； • 6）封閉時間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時以上或者4度封閉過夜； 7）抗體非特異性結(jié)合，可以降低抗體濃度，減少孵育時間 8）一抗稀釋度不適宜，可以對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度 9）一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結(jié)合過夜 10）抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時間 11）化學顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物 3.為啥條帶形狀不好看？ 答：可能的原因有： 1）膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻 2）某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致 3) 緩沖液陳舊，成分改變,可以重配 4) 凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走 5）電泳時溫度過高，可以降低電流或電壓 6）樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分攪拌混勻 4．蛋白條帶位置（大�。┎粚φφ�？ 答：可能的原因有： • 膠濃度不對，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度 • 抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長孵育時間 3）酶失活，建議直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 4）目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關文獻確定 5）標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設置陽性對照比對結(jié)果，增加標本上樣量 5．有很多雜帶咋回事？ 答：可能的原因有： 1）目的蛋白有多個修飾位點，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小 2) 樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作 3）雜蛋白多，建議處理目的蛋白 4）抗體特異性不強，建議使用特異性強的抗體 5）抗體孵育時間過久，建議減少抗體孵育時間 6）二抗與抗原有交叉反應，建議選擇合適的封閉物 7）二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過程及強度 8）底物顯色與曝光時間過長，建議縮短顯色及曝光的時間 6．背景有黑色斑點或不均勻的白色斑點和暗背景上白色帶 答：可能的原因有： • 1）抗體與封閉試劑反應，建議使用前過濾封閉試劑 2）HRP含量過高，建議降低酶聯(lián)二抗的濃 3）HRP偶聯(lián)二抗中有聚集體，建議過濾二抗試劑，去除聚集體 4）抗體分布不均勻，建議孵育抗體時使用搖床 7．細胞水平要做WB，多少細胞提的蛋白夠做WB？ 答：一般5×10^6就足夠。 8．為什么我的細胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？ 答：可能的原因有： 1）細胞中不表達這種蛋白質(zhì)，換一種細胞； 2）抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，是否有問題； 3）可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當，樣品放置時間過長； 4）細胞中的蛋白質(zhì)被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性。 9．我的目的帶很弱，如何加強？ 答：1）可以加大抗原上樣量，這是最主要的； 2）也可以將一抗稀釋比例降低； 3）還可以延長曝光時間。 10．我做的蛋白質(zhì)分子量很小(10KD)，怎么做WB? 答：1）可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系； 2）也可以選擇PSQ 膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。 11．大分子量蛋白200KD，在做WB要注意什么？ 答：1）做200kd蛋白的WB時要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時要小心； 2）轉(zhuǎn)移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）； 3）轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高哦! 12．如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？ 答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。 13．WB中抗體的可以重復應用嗎？ 答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復凍融。 14．上下槽緩沖液有何要求，怎樣能達到最佳效果？ 答：無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復使用過一兩次的緩沖液。 15．免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？ 答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和WB，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。 |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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做WB實驗是，會不會存在干擾因素？我最近查閱文獻發(fā)現(xiàn)，一種HA和另一種HAAA，也就是異嗜性抗體，和人抗動物抗體，會干擾多種檢測。這種抗體也是異源進入人體產(chǎn)生，那做WB檢測蛋白質(zhì)的時候，會不會因為出現(xiàn)人抗動物抗體的蛋白質(zhì)，而干擾WB準確性？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2018-02-24 16:03:54
2樓2018-02-05 16:08:19
4樓2018-03-22 15:27:27
5樓2018-05-04 14:43:35
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