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免疫組化中如何防止脫片
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聽到很多人抱怨，在免疫組化實(shí)際操作中遭遇過(guò)組織易脫片的問(wèn)題，今天我將結(jié)合一些個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，與大家分享簡(jiǎn)單易操作的解決方法。 方法一： 使用防脫玻片，組織當(dāng)然是越新越好。 方法二： 某些免疫組化染色時(shí)候，需要涉及多種抗原修復(fù)方法，如某實(shí)驗(yàn)需要雙修復(fù)（熱修復(fù)和酶修復(fù)），熱修復(fù)相對(duì)來(lái)說(shuō)是比較劇烈的（如放在 EDTA 中煮 1 min），沸騰的液體對(duì)組織還是有很大的沖擊力的，此時(shí)組織容易脫，如果熱修復(fù)放在酶修復(fù)后，則組織更容易脫，相反如果將不劇烈的酶修復(fù)放在熱修復(fù)后，可以減少脫片的發(fā)生。 但很多時(shí)候知道這些似乎解決不了問(wèn)題，不少研友們由于讀研時(shí)間僅僅 3 年，重新收集新鮮標(biāo)本顯然不可能，回顧性研究中，某些病例比較罕見，活檢取出組織也相對(duì)寶貴，且由于當(dāng)時(shí)條件限制等多種原因造成如下問(wèn)題： 空白片少，經(jīng)不起反復(fù)折騰； 回顧性研究中不可能使用新鮮的切片組織； 某些單位先前并沒(méi)有使用防脫載玻片保留組織標(biāo)本等。 這些給實(shí)驗(yàn)科研造成一些困境，以下是本人改良后的方法與心得（以無(wú)防脫的非新鮮組織為例，修復(fù)方式為熱修復(fù)和酶修復(fù)），脫蠟、水化及后續(xù)染色等處理均按原先各自的實(shí)驗(yàn)流程處理，這里僅介紹如何防脫。 如上所說(shuō)，先采用酶修復(fù)，后熱修復(fù)，一般熱修復(fù)是直接置于相應(yīng)的修復(fù)液中煮沸，期間還有可能使用高壓鍋。 1. 酶修復(fù) 各自抗原特性選擇，有些時(shí)候酶修復(fù)的時(shí)間是極其難把握的。時(shí)間太長(zhǎng)，消化過(guò)頭容易脫片；時(shí)間太短，抗原暴露不充分，這些都影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 建議：稀釋濃度，延長(zhǎng)時(shí)間。 缺點(diǎn)：不能使用說(shuō)明書推薦時(shí)間，需要自己摸索幾次。 2. 熱修復(fù) 本人嘗試如下改良（理論基礎(chǔ)：抗原修復(fù)時(shí)僅需要組織與修復(fù)液接觸，且只要薄薄的一層就能反應(yīng)）。 改良一： 敞開高壓鍋蓋，置一鐵架于修復(fù)液面，其上放置玻片，玻片上滴加修復(fù)液體（鐵架高度以沸騰修復(fù)液不會(huì)觸及玻片為妥）。為了防止玻片上的修復(fù)液揮發(fā)，可在滴加修復(fù)液后蓋上蓋玻片，提供熱源使修復(fù)液保持沸騰狀態(tài)，使用熱蒸汽加熱。 優(yōu)點(diǎn)：避免了組織在液體中的劇烈沸騰，減少脫片。 缺點(diǎn)：降低了抗原修復(fù)的溫度，可能導(dǎo)致某些抗原無(wú)法達(dá)到其修復(fù)所需溫度，使用此法可能需要適當(dāng)延長(zhǎng)熱修復(fù)時(shí)間。 改良二： 修復(fù)液煮沸后，滴加于載玻片上，覆蓋蓋玻片，用實(shí)驗(yàn)室常見的封口膜將玻片和蓋玻片包繞（包繞的目的不是為了隔絕空氣，而是防止蓋玻片移動(dòng)導(dǎo)致修復(fù)液在組織表面揮發(fā)，封口膜受熱后收縮，即可固定）。將包繞好的玻片置入鐵架上，按原先操作繼續(xù)（可放入高壓鍋中）。 優(yōu)點(diǎn)：避免了改良 1 中可能無(wú)法達(dá)到所需修復(fù)溫度的問(wèn)題，可以放入高壓鍋中。 缺點(diǎn)：所有片子變成平鋪展開，一次所能做的片子數(shù)目減少。 注意事項(xiàng)： 使用蓋玻片后，尤其是使用封口膜后，揭片的過(guò)程一定要輕柔，用鑷子，避免徒手操作，如遇到揭片困難，可適當(dāng)用 PBS 沖洗，不可暴力揭片，否則適得其反； 由于每個(gè)實(shí)驗(yàn)室條件不同，還應(yīng)根據(jù)自己所在實(shí)驗(yàn)室條件調(diào)整； 免疫組化步驟繁瑣，影響因素較多，出現(xiàn)問(wèn)題要仔細(xì)思考。以上兩個(gè)方法本人親測(cè)可有效解決脫片問(wèn)題，希望能幫助到大家。 |
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