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一路向北007木蟲 (著名寫手)
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[求助]
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105檢測(cè)問題 已有1人參與
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各位大俠，本人最近構(gòu)建表達(dá)載體（pCambia）總是出這樣的問題：自己構(gòu)建的克隆載體經(jīng)質(zhì)粒PCR檢測(cè)并經(jīng)過測(cè)序，均沒有問題。隨后將表達(dá)載體通過電擊轉(zhuǎn)化和凍融轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。28度培養(yǎng)箱培養(yǎng)約48小時(shí)，平板上都長(zhǎng)了單克隆，但是，（1）挑斑后搖菌有的搖不到渾濁（金黃色），仍然是澄清；（2）挑斑后搖菌終于有的搖到渾濁（金黃色），菌液PCR確檢測(cè)不到目的基因或者是條帶極弱。 實(shí)在是不知道是哪里出了問題，急求大俠幫忙分析一下，不勝感激！ |
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zjx891211
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2018-04-18 07:57:25
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2018-04-18 07:57:25
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搖不起來的應(yīng)該就是假陽性，搖起來p不出來的情況很多見，農(nóng)桿菌多糖含量較高，taq酶結(jié)合位點(diǎn)可能被糖蛋白包裹以致于taq酶結(jié)合不上去沒法擴(kuò)增，解決辦法提個(gè)質(zhì)粒，一般能提出質(zhì)�；揪褪橇�，不過還得進(jìn)一步檢驗(yàn)，手提質(zhì)粒的話多糖蛋白去除比較干凈，因此酶切或是pcr鑒定都可以，推薦酶切，pcr假陽性概率高。試劑盒提質(zhì)粒的話酶切不是特別好用，可能切不開，pcr可用但還是假陽性概率問題 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
2樓2018-04-09 23:48:38
pjxiongjing
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大腸桿菌菌液檢測(cè)弱，提質(zhì)粒檢測(cè)能擴(kuò)增出條帶，酶切測(cè)序都對(duì)，轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌長(zhǎng)得少，擴(kuò)增條帶弱，還是保存半年后活化，有菌生長(zhǎng)，但PCR擴(kuò)增不出來 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2018-04-10 00:17:36
Neo2000
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4樓2018-04-10 14:07:04
chenwei2551
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5樓2018-04-11 19:23:16
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6樓2018-04-18 00:34:37
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7樓2018-04-18 00:35:07
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8樓2018-04-18 14:09:40
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