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引物設(shè)計添加信號肽，求助大神們！��！
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各位大神，我的老板最近想要在我們設(shè)計的引物上添加信號肽，使目的蛋白表達(dá)為信號肽（我們蛋白原本為包涵體蛋白）。 我查了一些資料，現(xiàn)在有幾個問題，望大神們能幫幫忙~~ 1.有的資料說含有信號肽引物設(shè)計時，應(yīng)當(dāng)是“保護(hù)堿基+ATG+信號肽+ATG+目的序列”，應(yīng)當(dāng)是這樣嗎？兩個起始子是否會影響我的目的蛋白的表達(dá)？或者可以添加在下游終止子前面？ 2.對于信號肽序列，是根據(jù)什么要求在引物中添加呢？是否是信號肽序列就可以？部分資料中的信號肽序列都好長啊~，如果按照這個要求設(shè)計引物，勢必會對上下游引物的退火溫度等相關(guān)數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響，而且會影響PCR的結(jié)果，是否有相關(guān)方法可以避免呢？ |
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2樓2018-05-07 12:46:48
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西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2018-05-08 07:56:39
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2018-05-08 07:56:39
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不太明白你的意思，做分泌蛋白表達(dá)的話是根據(jù)你的表達(dá)系統(tǒng)的。我們實驗室做真核表達(dá)體系，一般用哺乳動物的信號肽，如果你用原核生物表達(dá)當(dāng)然就用原核生物的信號肽了。如果你蛋白本身為包涵體蛋白你分泌表達(dá)不會影響它正常的結(jié)構(gòu)嗎？添加信號肽你用重疊PCR就行，先重疊P出信號肽，然后用酶切酶連的方式放到起始密碼子前，真核生物的話，在信號肽后會放一段Kozak序列用來增強表達(dá)。至于你說的保護(hù)堿基一般用6到8個，反正便宜，我們一般都用8個，這只是用來方便酶切后把信號肽連上載體上的，平末端的話，你只需要一半就行，不用加保護(hù)堿基。真核生物信號肽就100多核苷酸吧，不是很多吧分成幾段重疊延伸很容易就出來了。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2018-05-08 00:20:30
4樓2018-05-09 11:21:23
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