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87115wh木蟲 (小有名氣)
七吃喀嚓
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[求助]
用石蠟切片做小鼠腸道組織的免疫熒光，一直不出結(jié)果
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各位大神，一年級(jí)小博求助，目前處于開題階段，定下來(lái)通過(guò)免疫熒光的方法，識(shí)別組織上目的蛋白的表達(dá)位置，但通過(guò)4μm石蠟切片做免疫熒光，一直目的蛋白一直沒(méi)有熒光。。。期間用同樣的一抗二抗，通過(guò)其他未經(jīng)石蠟包埋的組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有熒光，在腸道細(xì)胞上做，同樣也有熒光，只是用石蠟切片做不出來(lái)，實(shí)驗(yàn)方法如下： 1. 取小鼠腸道組織，bouin’s液固定4℃ 12h 2. 棄去bouin‘s液，組織于50%乙醇中4℃洗1h，70% 乙醇4℃ 1h洗三次，直至組織發(fā)白 3. 制作4μm石蠟切片 4. 石蠟切片室溫下風(fēng)干12h，并于烘箱中65℃孵育30min 5. 脫蠟：分別于二甲苯Ⅰ、Ⅱ及1:1的二甲苯/乙醇中于室溫下浸泡20min 6. 再水化： 100%、95%、80%、70%、50%、30%的梯度乙醇，室溫下各4min 7. PBS室溫下漂洗3次，每次2min 8. 通透液（40mL PBS + 120μL triton-100 ，室溫下避光孵育40min 9. PBS室溫下漂洗3次，每次2min 11. 0.01M 檸檬酸鈉浸泡組織，微波爐中中火15min，或高壓滅菌鍋121℃ 10min，取出后自然冷卻至室溫 12. PBS室溫下漂洗3次，每次5min 13. 通過(guò)體積比為1:20的二抗同源動(dòng)物血清封閉，37℃ 30min，不洗直接孵一抗 14. 一抗在37℃ 下孵育2h或4℃ 過(guò)夜 15. PBS 37℃下漂洗3次，每次15min 16. 二抗-TRITC或二抗-FITC在37℃ 下孵育2h，避光 17. PBS 37℃下漂洗3次，每次15min，避光 18. 通過(guò)抗熒光淬滅劑（含DAPI）封片，觀察 所測(cè)目的蛋白為膜蛋白，DAPI染色效果良好，用凝集素識(shí)別其他蛋白效果也很好，就是目的蛋白標(biāo)記不出來(lái)，文章中也有導(dǎo)報(bào)通過(guò)冰凍切片可以做出熒光染色結(jié)果，但小弟冰凍切片技術(shù)欠佳，做出來(lái)的片子根本無(wú)法觀察。。。。為了保持組織形態(tài)，一直在做石蠟切片，但就是不出結(jié)果。。。 在此求助各位大神，感激不盡感激不盡�。�！  |
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