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annalic新蟲 (初入文壇)
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[交流]
Sal1和sac2雙酶切構(gòu)建表達(dá)載體 已有2人參與
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載體用的是pDG160質(zhì)粒，進(jìn)行sal1和sac2雙酶切3.5小時(shí),連接的片段經(jīng)PCR后雙酶切，再進(jìn)行5ul體系T4連接16℃過夜，加20ul感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化涂布，挑取長出的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果菌落PCR有片段，但酶切驗(yàn)證無片段。求助各位，到底是哪里的問題，酶切不徹底嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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ma08105
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2018-05-16 07:56:59
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1、送測序看看 2、會(huì)不會(huì)是菌落PCR的引物用的是片段上的而不是載體上的 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
2樓2018-05-15 23:34:46
annalic
新蟲 (初入文壇)
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我后來用空載質(zhì)粒做PCR發(fā)現(xiàn)也能P出跟連接片段長度相仿的片段，所以只能認(rèn)定做PCR驗(yàn)證是無效的。我的結(jié)果出現(xiàn)假陽性，不知道是否是酶切的緣故，我的載體和片段濃度挺高的，不知道這兩種酶雙酶切多長時(shí)間合適，而且這兩種酶活都是15U／ul.不知道前輩有沒有經(jīng)驗(yàn) 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2018-05-16 07:35:59
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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這兩個(gè)酶的酶切效率還是比較高的 不知道你用的是哪個(gè)公司的連接酶，連接的時(shí)間可以不用這么久，以前Takara、NEB的酶都用，現(xiàn)在基本都用Fermentas的T4，室溫連接上幾十分鐘，連接時(shí)間太久會(huì)導(dǎo)致假陽性，建議可以減少連接時(shí)間，降低背景 然后就是菌落PCR，不知道你鑒定了多少個(gè)斑，菌落PCR確實(shí)會(huì)有假陽性，我一般長的斑少就都挑，多的話挑上十幾個(gè)，PCR后選擇陽性斑，如果陽性斑多，就選擇那些條帶最強(qiáng)的，這里一定要記住加上對照組，陽性對照可以使用你的插入片段，或者帶有插入片段的質(zhì)粒，證明PCR是成功的，陰性對照為空載體和水作為模板，證明PCR產(chǎn)物是特異的，然后再將陽性克隆搖菌進(jìn)行酶切鑒定，一般認(rèn)為酶切鑒定是準(zhǔn)確的 如果你的片段不長，也比較好連接，應(yīng)該是存在陽性克隆的，如果斑長的多，就再多挑幾個(gè)去鑒定 祝好！ |
4樓2018-05-16 18:50:21
5樓2018-05-16 18:52:56
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