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103007054025銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
一個表達載體里插入兩個蛋白在大腸桿菌中實現(xiàn)同時表達 已有3人參與
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大家好，我有一個問題想咨詢一下大家，現(xiàn)在有兩個蛋白MW分別是36KD和40KD,而且這兩個蛋白在酶促反應中是共同起作用的， 因此我想做一個共同表達，即在一個表達載體里插入兩個蛋白，分別表達這2個蛋白，想把這兩個蛋白構(gòu)建在同一個讀碼框內(nèi)，那么在構(gòu)建載體的時候，有幾個問題想咨詢一下大家： （1）是否可以共用同一個啟動子？共用同一個啟動子的話表達效率怎么樣，有沒有做過的呀？ （2）目的基因1的終止密碼子是否需要去除？ （3）目的基因1與目的基因2之間是否需要加上一個柔性Linker？ （4）構(gòu)建的結(jié)構(gòu)是這樣：啟動子--操縱子--RBS--目的基因1---柔性Linker--目的基因2---終止密碼子---terminator還是 啟動子--操縱子--RBS--目的基因1---終止密碼子---柔性Linker--目的基因2---終止密碼子---terminator |
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1，原核生物中,一個啟動子可以同時啟動多個基因。在真核生物中,一般一個啟動子只能啟動一個基因（一般一般一般）。 2，目的基因1的終止子問題，有這個終止子那么就是兩個基因，去掉這個終止子，如果閱讀框不移碼，那兩個基因此時可以認為是一個基因（也就是你想說的融合蛋白）。此時一個啟動子就足夠了。所以如果用一個啟動子 那么基因1的終止子必須去除。 3，linker需要�。ㄟ@個要不要主要跟你的蛋白有關(guān)，融合蛋白要發(fā)揮功能要保證不能大范圍破壞原始蛋白的三級結(jié)構(gòu)，比如你要融合的是簡單的標簽蛋白那么久沒有必要加linker.。但是你要融合的是兩個復雜的功能蛋白，最好加linker）。 4，中間有終止子后面的還怎么繼續(xù)翻譯？so...... 祝樓主實驗順利！ |
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1030070540252樓2018-06-06 17:21:24
3樓2018-06-06 17:55:12
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可以用雙啟動子表達載體，比如Novagen的 pACYCDuet系列，兩個T7 啟動子。 也可以用一個啟動子進行串聯(lián)表達或者融合表達。4樓已經(jīng)說了具體內(nèi)容。 但是融合表達對兩個酶的活性有沒有影響？這個不能確定。如果要靠譜的話，建議把融合表達作為平行實驗，這樣即使表達后萬一沒有活性也不那么影響進度。  |
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5樓2018-06-07 03:54:51
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可以插入兩個蛋白基因在一個載體上面表達，我干過，相當不錯。 你這各個元件的分布有問題，可以這樣: ........RBS-目的基因1-終止子-RBS-目的基因2-終止密碼子-terminator 中間不一定需要linker |
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4樓2018-06-06 20:27:00
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6樓2018-06-09 18:32:00
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7樓2018-06-09 18:32:54
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8樓2018-06-09 18:33:11
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10樓2018-07-16 10:20:36
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