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SBP2哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的構(gòu)建和動(dòng)物模型研究
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SBP2缺陷是2005年首次發(fā)現(xiàn)的唯一可引起人類遺傳性甲狀腺激素代謝缺陷的疾病，患者表現(xiàn)為以生長(zhǎng)遲緩和甲狀腺功能異常為主的復(fù)雜臨床癥候群。SBP2 的突變會(huì)引起硒蛋白減少，進(jìn)而導(dǎo)致脫碘酶( deiodinase-2， DIO2) 活性降低和甲狀腺激素代謝異常，以及青春期前生長(zhǎng)停滯。進(jìn)行SBP2哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的構(gòu)建，為分析其對(duì)硒蛋白P基因轉(zhuǎn)錄水平的影響提供了方法。而建立SBP2缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠模型有助于SBP2缺陷疾病機(jī)制和治療的研究。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子，可用于重組蛋白藥物和診斷原料試劑盒的開發(fā)及應(yīng)用等。美迪西所提供的哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)基于無(wú)血清培養(yǎng)體系提供基因表達(dá)優(yōu)化、瞬時(shí)表達(dá)、穩(wěn)定表達(dá)及抗體生產(chǎn)等多種真核蛋白服務(wù)項(xiàng)目。美迪西科研人員建立了成熟的哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)及純化服務(wù)平臺(tái)，提供哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)與純化服務(wù)。 1、SBP2基因哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的構(gòu)建 克隆硒半胱氨酸插入序列(SECIS)結(jié)合蛋白(SBP)2基因，并構(gòu)建其哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，導(dǎo)入293T細(xì)胞進(jìn)行初步表達(dá)，分析其對(duì)硒蛋白P基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。方法是應(yīng)用酶切的方法從保存的質(zhì)粒p CMV-XL4-SBP2中將目的基因切割下來(lái)，并利用雙酶切連接法將其連入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pc DNA3.1(+)。 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)SBP2基因的表達(dá)以及其超表達(dá)對(duì)硒蛋白P基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。同時(shí)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中添加無(wú)機(jī)硒后研究其對(duì)SBP2和硒蛋白P基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。結(jié)果成功構(gòu)建了SBP2表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.1-SBP2，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后實(shí)現(xiàn)基因的超表達(dá)，同時(shí)添加硒對(duì)SBP2基因的表達(dá)有明顯影響。 研究發(fā)現(xiàn)SBP2基因的超表達(dá)顯著提高硒蛋白P的轉(zhuǎn)錄水平，添加硒進(jìn)一步增加了硒蛋白P的轉(zhuǎn)錄。因此 SBP2哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的成功構(gòu)建以及SBP2超表達(dá)后的作用分析為下一步深入研究硒蛋白的生物合成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 2、Sbp2基因動(dòng)物模型研究 SBP2是硒蛋白合成中硒代半胱氨酸摻入的必需因子，純合敲除該基因的小鼠在原腸胚形成前死亡，由此推測(cè)攜帶SBP2基因突變的患者體內(nèi)應(yīng)殘留部分SBP2的生物學(xué)功能。然而該病的具體機(jī)制仍未闡明，因此急需建立用于該病研究的動(dòng)物模型。德國(guó)一研究小組建立了Sbp2基因整體和組織特異性敲除的小鼠模型，然而這些模型均未顯示SBP2缺陷患者特有的臨床表型，因此用于該病機(jī)制和治療的研究?jī)r(jià)值有限，新的動(dòng)物模型尚有待進(jìn)一步研究。 MCT8是一種甲狀腺激素特異性胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，MCT8基因突變引起一類伴有甲狀腺功能異常的X連鎖精神運(yùn)動(dòng)性遲緩綜合癥。自2004年MCT8基因突變患者首次報(bào)道以來(lái)，已有超過200多例來(lái)自100多個(gè)不同種族家系的患者存在該基因的缺陷。然而目前尚未建立以皮膚成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外模型以研究患者臨床表型與基因型之間的關(guān)系。 建立SBP2缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，以模擬患者的臨床表型常染色體隱性遺傳的SBP2缺陷患者體內(nèi)仍保留部分SBP2的生物學(xué)功能。發(fā)現(xiàn)低硒或外源性L-T4刺激的Sbp2雜合突變小鼠部分復(fù)制SBP2缺陷患者的甲狀腺功能異常。MCT8基因R388Q突變?yōu)榱夹酝蛔�，不影響MCT8的甲狀腺激素胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能。 |
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