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Western印跡分析在研究NM23B基因細(xì)胞增殖作用上的應(yīng)用
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NM23是一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和個(gè)體發(fā)育具有調(diào)控功能。目前NM23已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10個(gè)亞型，研究較為透徹的是NM23A和NM23B，運(yùn)用western印跡分析發(fā)現(xiàn)NM23B對(duì)體外培養(yǎng)的SD大鼠具有肝細(xì)胞增殖作用。western印跡分析又稱(chēng)免疫印跡分析，是根據(jù)抗原、抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。 由于免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，可檢測(cè)低至1-5ng（最低可到10-100pg）中等大小的靶蛋白，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)，也是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法，美迪西生物醫(yī)藥可以提供蛋白印跡實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。 1、nm23蛋白的作用機(jī)理 nm23蛋白與果蠅的awd蛋白和二磷酸核苷激酶（ndpk）這兩類(lèi)蛋白高度同源: （1）果蠅的awd蛋白 人的nm23蛋白與awd蛋白的氨基酸序列有77%～78%是相同的，awd蛋白在果蠅胚胎發(fā)育上起重要調(diào)節(jié)作用，如awd基因突變或表達(dá)降低，將導(dǎo)致果蠅的許多組織器官的畸形分化和翅盤(pán)細(xì)胞的死亡。據(jù)此推測(cè)nm23蛋白可能是正常組織發(fā)育所必須的，如果nm23蛋白失活或減少將導(dǎo)致一種有利于畸形分化和腫瘤轉(zhuǎn)移的紊亂狀態(tài)。 （2）二磷酸核苷激酶（ndpk） 二磷酸核苷激酶（ndpk）是細(xì)胞中普遍存在的一種多功能同質(zhì)酶家族，主要分布于胞漿和質(zhì)膜上，功能涉及依賴(lài)ntp（三磷酸核苷）的細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程。ndpk通過(guò)催化這一反應(yīng)影響微管聚合、紡錘體形成并調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。其異常一方面引起細(xì)胞染色體非整倍體畸變而破壞細(xì)胞正常形態(tài)結(jié)構(gòu)及促進(jìn)腫瘤發(fā)生，另一方面通過(guò)影響細(xì)胞骨架對(duì)細(xì)胞信號(hào)反應(yīng)的改變，引起細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而參與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。nm23蛋白顯示有ndpk活性，因此很可能通過(guò)與ndpk一致或相似的途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化等過(guò)程中發(fā)揮作用。 2、NM23促進(jìn)細(xì)胞增殖 觀察NM23B在體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞增殖中的作用，方法是構(gòu)建NM23B過(guò)表達(dá)載體和干擾載體及其陰性對(duì)照載體，分別轉(zhuǎn)染SD大鼠BRL-3A肝細(xì)胞，并設(shè)空白對(duì)照組（CON）、干擾NC組（siRNA-NC）、干擾組（siRNA）、過(guò)表達(dá)組（OE）、過(guò)表達(dá)NC組（OE-NC），通過(guò)定量PCR分析各組細(xì)胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA變化。 Western印跡分析比較各組細(xì)胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA蛋白的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期比例，用細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)（CCK 8）法檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn) （1）過(guò)表達(dá)組OE組Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表達(dá)量較CON組顯著增多（P<0.05）。 （2）另一方面干擾組siRNA組的Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表達(dá)量較CON組顯著降低（P<0.05），干擾NC組和OE-NC組與CON組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）； （3）OE組的G0/G1期細(xì)胞比例明顯低于CON組（P<0.05），siRNA組的G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于CON組（P<0.05）。同時(shí)OE組的S期細(xì)胞比例明顯高于CON組（P<0.05），siRNA組的S期細(xì)胞比例明顯低于CON組（P<0.05），siRNA-NC組和OE-NC組與CON組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖表明OE組的增殖速度明顯快于CON組（P<0.05），siRNA組的增殖速度明顯慢于CON組（P<0.05），siRNA-NC組和OE-NC組與CON組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 因此過(guò)表達(dá)NM23B可以加強(qiáng)Cyclin D1、PCNA的表達(dá)，縮短細(xì)胞周期，從而促進(jìn)肝細(xì)胞增殖；干擾NM23B表達(dá)則削弱了Cyclin D1、PCNA的表達(dá)，延長(zhǎng)細(xì)胞周期，從而抑制肝細(xì)胞增殖。證實(shí)了NM23B在體外培養(yǎng)SD大鼠肝細(xì)胞增殖中的作用，為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了理論基礎(chǔ)。 3、nm23與腫瘤的關(guān)系 nm23基因具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，在體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。在對(duì)黑色素瘤的細(xì)胞克隆研究中，發(fā)現(xiàn)nm23明顯抑制了黑色素瘤細(xì)胞的癌變過(guò)程，包括抑制了細(xì)胞活性、抑制腫瘤的發(fā)生、抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和改變了黑色素瘤的應(yīng)答。近年來(lái)，臨床檢查發(fā)現(xiàn)，nm23的表達(dá)與各種腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，而且對(duì)患者預(yù)后有重要影響。 研究表明，nm23基因的抑瘤作用具有組織特異性:在一些腫瘤，如乳腺癌、肝癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌等，nm23的蛋白表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)，其基因缺失與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，顯示了它作為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的特性；而在另一些腫瘤，如肺癌、前列腺癌、膀胱癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨腫瘤、子宮內(nèi)膜癌等，nm23基因的表達(dá)水平、缺失與腫瘤轉(zhuǎn)移似乎無(wú)關(guān)，但卻與腫瘤分化、增生和進(jìn)展有關(guān)；甚至在一些腫瘤，如神經(jīng)母細(xì)胞癌，當(dāng)其惡化或轉(zhuǎn)移時(shí)，nm23的表達(dá)量反而增高，似乎其表達(dá)水平增高與癌細(xì)胞增生相關(guān)。這些結(jié)果說(shuō)明nm23基因不僅作為一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因而起作用，尚還有更多的其它生物學(xué)功能。 因此nm23基因不僅僅具有細(xì)胞增殖租用，還具有執(zhí)行腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能。然而nm23基因并非在所有類(lèi)型腫瘤中都表現(xiàn)為癌轉(zhuǎn)移的抑制功能，研究表明其作用具有組織差異性，出現(xiàn)這種差異性的機(jī)制尚不明確，說(shuō)明人們對(duì)nm23基因的全面認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)未完成，尚需進(jìn)行更深入的研究。 |
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