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fast-rui新蟲 (小有名氣)
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[交流]
異源表達(dá)蛋白遇到問題 已有8人參與
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本人最近在做異源表達(dá)，用的pet28a表達(dá)載體，宿主菌是BL21，od搖到0.6-0.8，16℃誘導(dǎo)19h，做了幾次蛋白大部分都在包涵體中，iptg濃度試過0.1-0.8mM的。這次打算試試培養(yǎng)基多調(diào)幾個(gè)ph試試。 但是想問就是我的蛋白等電點(diǎn)是6.74，LB的ph會(huì)影響表達(dá)嗎？破碎的時(shí)候蛋白裂解液的ph設(shè)為多少比較合適？有沒有大神可以給我點(diǎn)建議，看看能不能把包涵體減少。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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2樓2019-06-11 21:03:08
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對(duì)于在溫度稍高容易形成包涵體的蛋白質(zhì)，搖到od以后要等菌液冷卻一點(diǎn)再加iptg，因?yàn)榘w的形成有可能形成慣性，一旦開始形成，扭轉(zhuǎn)需要時(shí)間。如果不容易形成包涵體的蛋白質(zhì)，不必降溫再誘導(dǎo)。 用BL21容易形成包涵體，用大腸桿菌的其它菌株只能是改善，不會(huì)根治，因?yàn)橥粋�(gè)物種的折疊系統(tǒng)大同小異。換宿主可能要換物種。 加一段融合蛋白質(zhì)可能改善但不一定根治，而且不能確定會(huì)不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的本身性質(zhì)有改變。具體要什么樣的性質(zhì)或可以接受什么樣的性質(zhì)，問你導(dǎo)師。 復(fù)性不一定可行，因?yàn)椴灰欢芡耆珡?fù)性，而且即使部分復(fù)性形成可溶蛋白質(zhì)，其性質(zhì)也不一定與正確折疊得到的蛋白質(zhì)性質(zhì)一致。具體要什么樣的性質(zhì)或可以接受什么樣的性質(zhì)，問你導(dǎo)師。 你把長(zhǎng)得快的菌液拿出來放在室溫下短時(shí)間不會(huì)影響菌體狀態(tài)，最多就是因?yàn)榻佑|氧氣不足造成生長(zhǎng)緩慢。要是你擔(dān)心，就放在溫度稍低的搖床繼續(xù)搖，大腸桿菌在28度的生長(zhǎng)溫度約為37度下八分之一。 要是還有能夠維持更低溫度的搖床，就繼續(xù)降低溫度。大腸桿菌在iptg存在時(shí)不會(huì)完全停止生長(zhǎng)，但在這么低的溫度下就更慢。OD600為1.5時(shí)誘導(dǎo)，10度。 很低溫度時(shí)，搖床壓力大，或直接走極端，放在4度冰箱時(shí)不時(shí)拿起來?yè)u一搖。 |
15樓2019-06-14 00:40:45
kindermoon
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16樓2019-06-14 13:40:23
3樓2019-06-11 22:22:47
fast-rui
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4樓2019-06-11 22:44:34
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5樓2019-06-11 22:45:04
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6樓2019-06-12 01:13:04
7樓2019-06-12 08:33:18
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兩個(gè)方案，用pGEX4T-1這樣的融合表達(dá)系統(tǒng)，二是用rosetta這樣的宿主菌 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2019-06-12 09:20:44
fast-rui
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誘導(dǎo)時(shí)機(jī)早一點(diǎn)是啥意思呀，是誘導(dǎo)時(shí)間短一點(diǎn)還是搖到od趕緊誘導(dǎo)？？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
9樓2019-06-12 10:08:00
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10樓2019-06-12 10:08:49
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