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EAZY丿新蟲 (初入文壇)
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 小弟在做一個(gè)原核構(gòu)建，使用了一個(gè)特殊載體，載體上MCS只有BamHI和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)，且載體前后是冗長(zhǎng)重復(fù)的回文序列，不易進(jìn)行同源重組，因序列里面含有同樣的BamHI酶切位點(diǎn)，也無法進(jìn)行酶切酶連，求助蟲友，請(qǐng)問還有什么可行的構(gòu)建方法嗎，謝謝！ |
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pennchem
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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（1）雙酶切目標(biāo)質(zhì)粒 （2）根據(jù)雙酶切后兩端序列，重新設(shè)計(jì)引物PCR靶標(biāo)序列，使擴(kuò)增產(chǎn)物與雙酶切后質(zhì)粒兩端同源 （3）將切后的質(zhì)粒與PCR混在一起，然后加入T5外切酶（控制時(shí)間和溫度） （4）加入Klenow酶補(bǔ)齊 （5）轉(zhuǎn)化 更簡(jiǎn)便的方法： 做同義突變，將目的基因中bamHI的位點(diǎn)突變掉 更偷懶的方法： 大量PCR產(chǎn)物后，部分酶切，分離出切了一次和切了兩次的PCR產(chǎn)物，然后選長(zhǎng)的那個(gè)連接 |
2樓2020-11-13 11:47:55
3樓2020-11-13 22:28:00
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