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墨小誄新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
請(qǐng)教！雙酶切一直不成功
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想做原核表達(dá)。TA克隆測(cè)序成功的質(zhì)粒以及PET-28a載體雙酶切后連接。TA克隆時(shí)連接的載體是全式金的simple cloning vetor。 質(zhì)粒1與pet28a是用HindIII和BamHI（takara的快切酶）。質(zhì)粒2與pet28a是用NcoI和BamHI（takara的快切酶）。采用的先30度3小時(shí)切BamHI，然后37度3小時(shí)切HindIII（質(zhì)粒2相同條件）。用的50的體系，兩種酶各1，green buffer5，質(zhì)粒3。 酶切后電泳圖如下，質(zhì)粒1，2長(zhǎng)度約2000bp,泳道1為5000marker,后幾個(gè)孔分別為質(zhì)粒1，載體，質(zhì)粒2，載體。 想問(wèn)的問(wèn)題: 1.酶切后直接電泳？看到有朋友先高溫失活再電泳。 2.酶切不成功，但是條帶怎么這樣？求解 3.如何正確酶切？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
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snoopyzxx
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墨小誄(fuyuandj86代發(fā)): 金幣+2 2021-01-30 11:34:20
墨小誄(fuyuandj86代發(fā)): 金幣+2 2021-01-30 11:34:20
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切沒(méi)切開(kāi)，你要同時(shí)跑沒(méi)有酶切的質(zhì)粒。切前切后發(fā)現(xiàn)有區(qū)別的。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
5樓2021-01-22 13:13:02
fuyuandj86
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(1) 無(wú)論是高溫失活后再電泳還是直接電泳應(yīng)該都不礙事 (2) pet28a是不是切出來(lái)了這個(gè)圖看不出來(lái)，因?yàn)榍谐鰜?lái)的短片段太小了，所以理論上只能看到一個(gè)相當(dāng)于pet28a載體長(zhǎng)度的線性片段 (3) 檢查一下雙酶切buffer是不是合適，同時(shí)用兩個(gè)酶切的話buffer按這個(gè)表格走：https://www.takarabio.com/us/pro ... e_digestion_buffers |
2樓2021-01-20 17:18:53
jurkat.1640
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3樓2021-01-22 12:19:28
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4樓2021-01-22 13:12:22
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