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分子診斷試劑中的“酶”你不行
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在做分子實驗，誰也缺不了對基因進行定量定性，PCR是最經(jīng)典的方法。然而實驗結(jié)果是否可靠并好看和分子酶的質(zhì)量是絕對相關(guān)。 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的核苷酸片段的分子生物學技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊核苷酸復制，PCR的最大特點是能將微量的核苷酸進行大幅擴增，從而達到容易鑒定和識別程度。 PCR到底需要哪些種類的酶？請看中心法則，分子生物學的中心教條。體外的各種聚合酶鏈式反應(yīng)就是中心法則的完美運用。 DNA聚合酶——又稱DNA依賴的DNA聚合酶 它是以DNA為模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一類酶。DNA聚合酶根據(jù)聚合酶活力特征和外切酶活性特征的不同，有可以分為多種。在IVD領(lǐng)域中比較常見的酶如下： Bst DNA Polymerase (Large Fragment) Bst DNA聚合酶是來源于源于 Bacillus stearothermophilus DNA Polymerase I，通過基因工程手段去除了其5'-3'外切酶活性，而保留了5'-3'聚合酶活性。該酶具有很強的鏈置換能力，因此是Isothermal amplification (LAMP, RT-LAMP)的絕佳用酶。與野生型Bst DNA聚合酶(大片段)相比，該酶在擴增速度、產(chǎn)量、耐鹽性和熱穩(wěn)定性等方面均有大幅提高，同時，該酶可以使用dUTP作為底物進行擴增(Bst大片段無此活性)，非常適合于防污染的等溫擴增反應(yīng)。 由于此次新冠的影響，Bst成為IVD領(lǐng)域內(nèi)又一個DNA聚合酶寵兒。 Bsu DNA Polymerase (Large Fragment) Bsu DNA Polymerase (Large Fragment)保留了Bacillus subtilis DNA聚合酶I的5'→3' DNA聚合酶活性，但是缺失了5'→3' 核酸外切酶結(jié)構(gòu)域；該大片段自身缺乏3'→5'外切酶活性，是具有鏈置換活性的DNA恒溫擴增聚合酶。 逆轉(zhuǎn)錄酶——又稱為RNA依賴的DNA 聚合酶 該酶以RNA為模板，按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA (complementary DNA，CDNA)。 先達基因逆轉(zhuǎn)錄酶是來自莫洛尼小鼠白血病病毒（Moloney Murine Leukemia Virus）經(jīng)改造的RNA導向的DNA聚合酶，保留了該逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性，RNase H可以特異性的水解DNA-RNA雜合鏈中的RNA；提高了熱穩(wěn)定性，耐受溫度可達55℃；并具有極強的延伸能力，可以高產(chǎn)量制備全長的第一鏈cDNA，產(chǎn)物cDNA可從100 bp-15 kb。 一款PCR/RT-PCR必加的UNG Cod UNG（熱敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶）是來自Atlantic Cod的Cod Uracil-DNA糖基化酶，能在室溫下有效地水解單鏈或雙鏈DNA上的尿嘧啶，對RNA無活性。Cod UNG對RNA無活性，主要應(yīng)用于PCR擴增產(chǎn)物的防污染。 該酶是PCR、RT-PCR及qPCR等分析方法中消除carry-over污染的理想選擇。在分子診斷中，即使痕量的DNA污染也能顯著降低檢測靈敏度，因此，UNG酶在分子診斷領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛。 與其他來源UNG酶相比，Cod UNG酶具有高酶活、在溫和熱處理條件下（55℃）能夠完全、不可逆失活等優(yōu)勢，能夠提高PCR反應(yīng)的效率及靈敏度，并能提高PCR產(chǎn)物的長期穩(wěn)定性，便于下游應(yīng)用，如克隆構(gòu)建、測序等。 Cod UNG適用于常見的緩沖體系，兼容多種樣本類型。Cod UNG的優(yōu)異性能，使其易于使用、便于自動化操作、兼容絕大多數(shù)工作流程，如PCR、qPCR、RT-PCR等。 全能核酸酶--生物制品規(guī)�；a(chǎn)解決核酸殘留困擾 全能核酸酶是來自Serratia marcescens，經(jīng)基因工程改造的核酸切酶。該酶能將核酸降解成2~5個堿基的5'-單磷酸核苷酸，能高效地降解任何形式（單鏈，雙鏈，線狀，環(huán)狀）的DNA和RNA而沒有蛋白裂解活性。 重組蛋白純化或組織細胞樣品蛋白提取時，全能核酸酶可以去除核酸污染，有效降低樣品粘度，便于下游操作；在細胞或細菌裂解液中加入全能核酸酶，可去除粗提物中的核酸，降低溶液粘度，從而增加蛋白產(chǎn)量；減少存放的外周血單細胞（PBMC）的結(jié)塊現(xiàn)象；有效去除帶負電荷的核酸對雙向SDS-PAGE蛋白樣品的影響，改善蛋白質(zhì)的分離效果，增強二維電泳分辨率；去除疫苗（蛋白質(zhì)類）和病毒樣品制備中的DNA污染。 無論在實驗室研究還是在工業(yè)級生產(chǎn)的過程中，全能核酸酶是去除生物制品中所有形式DNA和RNA的一種有效工具酶。通過高效的核酸去除，可顯著提升后續(xù)實驗、生產(chǎn)的效果及產(chǎn)量，性能優(yōu)于其他核酸去除方法。 ERA技術(shù) ERA技術(shù)（Enzymatic Recombinase Amplification，酶促等溫擴增技術(shù)）是先達基因公司研發(fā)的具有全球自主知識產(chǎn)權(quán)等溫核酸擴增技術(shù)利用抗體制藥領(lǐng)域先進的分子設(shè)計、蛋白定向進化、核酶親和力成熟等技術(shù)對來源于細菌， 病毒和噬菌體的DNA聚合酶、核酸內(nèi)切酶等工具酶的分子結(jié)構(gòu)和功能進行改造和優(yōu)化，從而建立了全新的酶促等溫擴增技術(shù)。ERA技術(shù)方法可在恒定溫條件下，7~10分鐘即可對痕量靶DNA/RNA特異性區(qū)段擴增數(shù)億倍，其低溫適應(yīng)性和靈敏度等方面均取得了重大突破。目前，該技術(shù)方法已申請了國家專利和國際專利（申請?zhí)枺?01910262085.3; PCT201910262085.3)。 ERA技術(shù)產(chǎn)品的特點： 速度快，操作簡單，從樣品到出結(jié)果，20分鐘完成； 靈敏度高，可達1-10copies的極高檢測靈敏度。 耐抑制性強，樣品只需簡單處理，即可直接上樣反應(yīng)。 等溫擴增，設(shè)備要求低，最適溫度為37℃-42℃恒溫，降低對設(shè)備的要求，具有廣泛的設(shè)備通用性。 反應(yīng)與檢測閉管進行，避免氣溶膠污染，安全性高。 ERA提供了一種快速、準確、便捷的生物核酸檢測解決方案。 |
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