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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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【實(shí)驗(yàn)外包】流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡
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正常細(xì)胞中的磷脂酰絲短酸(Phosphatidylserine.PS)位于細(xì)胞障的內(nèi)側(cè).在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面即暴霆在細(xì)胞的外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子最在35~36KD的Ca2+依賴性研脂結(jié)合蛋白與PS有極高高親和力可以與之發(fā)生特異性結(jié)合將Annexin-V進(jìn)行熒光素(FITC)標(biāo)記成Annexin-V FITC探針 用該探針標(biāo)記待檢測細(xì)胞利用流式儀通過檢測FITC信號即可反應(yīng)帶警車細(xì)胞的凋廣情況。 當(dāng)然對于現(xiàn)有的調(diào)亡檢測試劑并沒有滿足于整體調(diào)亡情況的反映一般的試劑會(huì)結(jié)合碘化丙啶(propidine iodidePI)進(jìn)行更細(xì)層面的檢測，PI是一種核酸染料 它不能透過完整的細(xì)胞聰,但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞細(xì)胞瞳一般會(huì)發(fā)生破裂此時(shí)PI能夠細(xì)胞睡進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi) 嵌入到DNA中.使細(xì)胞核釋放紅色熒光。 在操作過程中不論是分離組織細(xì)胞或是收集培養(yǎng)中的細(xì)胞.需盡最避免污染一般收集1x106的細(xì)胞制備成1mL的細(xì)胞懸液按照凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作即可 但一定要注意整個(gè)過程需要輕柔操作.以免造成細(xì)胞是寫損傷而影響檢測結(jié)果。探針孵育完成后需在1小時(shí)以內(nèi)完成檢測.另外上機(jī)檢測時(shí)記得配上不做任何標(biāo)記的陰性對照管哦。 對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果首先我們需要在細(xì)胞自身光散射特性方面進(jìn)行評判。凋亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì)胞儀上前向散射光與細(xì)胞的大小有關(guān)而側(cè)向散射光反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)，在細(xì)胞周廣時(shí) 細(xì)胞周縮 體積變小 故前向散射光降低 這一特性往往被認(rèn)為是凋廣紙 胞的特點(diǎn)之一。此外細(xì)胞凋亡時(shí)由于染色體降解.核破裂形成 細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多,故凋亡細(xì)胞側(cè)向散射光常增加，細(xì)胞壞死時(shí).由于細(xì)胞腫脹 其前向散射光增大 則向散射光在細(xì)胞壞死時(shí)也增大 因此可根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光區(qū)別凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，但零要注意的是 根據(jù)前散時(shí)光和側(cè)向散射光判斷調(diào)廣細(xì)胞的可靠性受被檢測細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此我們必須要進(jìn)行凋亡因子的直接反映。 前面我們提到凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞由于其細(xì)胞膜損傷.P!能夠穿透細(xì)胞膜而嵌入DNA中 是細(xì)胞核產(chǎn)生紅色熒光。而細(xì)胞膜保持完好的早期周亡細(xì)胞對于細(xì)胞活性鑒定的染料P!有抗染性.則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生.正常活細(xì)胞與之相似，在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,所呈現(xiàn)的結(jié)果即為:左上象限顯示機(jī)械揭傷細(xì)胞為(FITC-/Pl+)左下象限顯示活細(xì)胞為(FITC-/PI-):右上象限是非活細(xì)胞.即壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞為(FITC+/P]+)而右下象限為早期周廣細(xì)胞呈現(xiàn)(FITC+/P1-)。 最后提醒一下想要做流式調(diào)亡檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)的科研汪們.由于用流式檢測凋亡時(shí).Pl受時(shí)間的影響很大,因?yàn)闃?biāo)記了PI后會(huì)加大細(xì)胞毒性隨著時(shí)間延長會(huì)導(dǎo)致PI的染色增加,特別是檢測早期凋亡時(shí)如果時(shí)間延長除了會(huì)導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外.誤差會(huì)明顯加大。根據(jù)以前做流式凋亡時(shí)的經(jīng)驗(yàn)建議每組實(shí)驗(yàn)一次可以先做三個(gè)復(fù)孔,上機(jī)前5分鐘加PI.最好在半小時(shí)內(nèi)檢測完畢。這時(shí)可以先分析下三個(gè)復(fù)孔的差異。等待摸索的實(shí)驗(yàn)條件成熟后.每組實(shí)驗(yàn)一次可以做6~8個(gè)復(fù)孔,然后做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。嚴(yán)格說來,當(dāng)做出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí).這樣的實(shí)驗(yàn)還要重復(fù)三次。但是因檢測凋亡時(shí),受細(xì)胞狀態(tài) PI染色時(shí)間,流式檢測時(shí)間,以及每次實(shí)驗(yàn)時(shí)的誤差等的影響外,很難保證能夠完全重復(fù)出上次的結(jié)果,甚至即使在保證了實(shí)驗(yàn)條件幾乎相同的情況下,每次重復(fù)的差異也會(huì)出現(xiàn)加大的情況。這時(shí)可以適當(dāng)重復(fù)2~3次,盡量使差異減小。 |
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