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醫(yī)學生物科研銅蟲 (小有名氣)
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【動物實驗百科】動物實驗設計原則和要點
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良好的動物實驗設計對提高研究工作質量，所寫的論文被高水平的雜志接受發(fā)表都非常重要。目前在生物醫(yī)學研究領域的動物實驗方面還存在不少低質量的研究工作，一方面是所用動物的質量不高，級別低給實驗結果的科學性帶來不小的影響，另一方面研究人員在實驗設計和統(tǒng)計學分析方面的訓練不足，也是導致研究工作質量低下的重要原因。 一個好的動物實驗設計，對統(tǒng)計學分析來說幫助很大，可以使問題變得更容易解決，而一個不正確的動物實驗設計，可能使我們不能從實驗結果中提煉出任何有用的信息。另外通過良好的實驗設計和統(tǒng)計學方法也可減少動物使用數(shù)量。對滿足動物實驗的倫理性和經(jīng)濟性要求也有重要的意義。 一般來說，動物實驗的研究工作應該明確描述： 研究的目的和/或者需要驗證的假說。 選擇特定動物模型的原因。 動物種、品系、來源和類型。 每個獨立實驗步驟的詳細描述，包括研究設計和使用動物數(shù)量，數(shù)據(jù)分析所用的統(tǒng)計學方法。 具體設計過程和原則如下： 01 動物實驗的分類 確證性的實驗：用一種最大可能,正確解答問題的系統(tǒng)方法，收集有關處理實施后動物反應的科學數(shù)據(jù)。 探索性的實驗：為產(chǎn)生新的假說提供素材。 這兩類實驗都涉及在實驗人員的控制下，對動物施加一定的處理或操作，來發(fā)現(xiàn)是否處理在實驗對象上引起一定的反應，或者對這種反應進行定量。 檢驗性實驗：是觀察性的實驗，用于發(fā)現(xiàn)科研人員不能控制的變量之間的聯(lián)系。這種聯(lián)系可能是暫時的也可能是長期的。 02 差異的分類和控制 1、實驗者帶來的差異 實驗者帶給實驗的差異主要有兩種。 （1）與正確恰當?shù)膶嶒灢僮饔嘘P，如：注射、灌胃口服、外科手術等； （2）缺乏準確的測量手段。 對第一種原因產(chǎn)生的差異，其控制應以確保實驗過程和操作的一致性、準確性和完整性為目的。對第二種原因產(chǎn)生的差異，其控制的主要方法就是對觀測數(shù)據(jù)進行多次測量。 2、動物帶來的差異 1）動物的來源的差異 由于遺傳漂變可能來源于不同供貨商的動物存在遺傳學的差異，隨后由于飼養(yǎng)的環(huán)境方面的差異造成表型上的差異。 加之，目前還沒有兩個供貨商是采用完全一樣的飼養(yǎng)管理程序或完全一樣的飼養(yǎng)環(huán)境。而動物在產(chǎn)后的發(fā)育階段是行為類型發(fā)育的敏感期，決定成年后保持行為類型和社會相互關系。因此有必要把動物來源的因素考慮到實驗的設計中，并采用適當?shù)目刂剖侄螜z查是否還應延長時間讓動物適應實驗環(huán)境。 2）動物飼養(yǎng)管理的差別 動物飼養(yǎng)管理方面的微小變化會對動物的行為、生化和生理產(chǎn)生就巨大的影響。如，在其他環(huán)境條件恒定不變的情況下，只改變飼養(yǎng)人員就可使小鼠的繁殖性能顯著下降。猜想這些影響群體性能的原因與視覺、聽覺或嗅覺有關。因此明智的做法是保證動物在新的環(huán)境和更換飼養(yǎng)人員的情況下，至少讓動物適應調整1周，才能開始實驗。 3）生活在不同的環(huán)境 動物對其生活的環(huán)境是敏感的，一個微小的變化都可以影響到它們的行為和生理學。這里我們強調的是動物所占據(jù)的空間—微環(huán)境的差別。例如，與進風口和排氣口的相對位置不同、垂直位置不同，會造成物理、化學和微生物組成的空間差異。這些情況我們在進行實驗設計時也應加以考慮。 4）動物健康狀況 臨床疾病會引起明顯的疾病癥狀，患病的動物是不能用來做實驗的。而亞臨床疾病不表現(xiàn)出疾病癥狀，不容易判斷它是否存在。它主要的影響有二。一是，疾病可能影響特定的器官，抑制它們的功能，改變動物的生理和生化狀態(tài)。如果這一功能是實驗過程的測定結果時，那么實驗結果很可能產(chǎn)生偏差。二是，亞疾病從廣義上講，對動物的健康造成不利影響，使動物對研究的操作影響變得敏感。 感染帶來的更大問題是疾病的嚴重程度根據(jù)動物的體質而變化，因此在實驗的整個動物群體中差別被加大。 5）動物之間相互作用引起的差異 A、動物是群居還是獨居要根據(jù)動物種屬的行為學特性而定。實驗前應了解所使用動物對群居的忍耐方式的不同，如，地鼠是獨居動物，在實驗條件下不適合群居生活；而小鼠的大多數(shù)品系獨居是一種應激情形。3-5只小鼠最佳，或獨居的動物給予一定的豐富生活的物品（遮掩物和玩具）可降低應激情形。 B、動物社會階層的建立，會影響到實驗的數(shù)據(jù)的差異。另外還要考慮動物建立社會等級的過程中，存在相當高的侵略性，群體中因而引起持續(xù)的應激和明顯影響動物行為學、生理學和生化特征的情況。實驗前將動物分組群居時，讓動物等級社會完全建立穩(wěn)定再進行實驗處理是十分必要的。 人員培訓的重要性 1）了解動物飼養(yǎng)管理的基本知識。 2）規(guī)范操作減少動物緊張和痛苦水平。 3）隨機化的處理安排減少處理動物對隨后動物處理的困難和帶來實驗數(shù)據(jù)差異。 一個有效減少由于不專業(yè)操作帶來的結果差異的方法是在單位建立專業(yè)化的中心設施和部門，由專業(yè)化的操作能手代替研究者進行操作。 03 實驗設計的步驟 1、開始階段 1）文獻查閱 查閱的文獻應廣泛包括現(xiàn)在和過去的雜志以及網(wǎng)絡上的信息資源，如，MEDLINE、TOXLINE、PUBMED、NCBI等，目的是了解清楚你所研究的焦點問題都已知道些什么，明確所用的方法、動物模型，排除不必要的重復研究。也是為IACUC審查提供項目不是重復研究、替代動物實驗的方法不可行、可能引起動物疼痛的操作已得到評估認可的證據(jù)。 2）確立科研方法 觀察和描述實驗中的現(xiàn)象， 系統(tǒng)地提出問題的解釋和學說， 利用學說預測新的觀察結果， 驗證學說。 3）問題的提出 明確提出問題、目標和可能的結果十分關鍵。提出的問題應包括實驗將要說明的問題和它的意義。目標應該對總目標有一個概括性的描述，對特殊的問題加以闡明。應對每一個實驗方案有兩個清晰的可能的結果（如，一個無效，一個預期）。無效結果明確兩實驗組間沒有差別，預期結果表明在實驗組之間有真實的差別。 4）動物模型的確定 為實驗選擇最適當?shù)膭游锬Ｐ停幸韵聨c建議：1使用系統(tǒng)發(fā)育水平最低的動物，2使用的動物具有想要的種屬或品系專一的特點或者具有特定研究目的必需的特點，3考慮在實驗期間得到和維持動物模型所需要的花費，4充分查閱文獻，與同一領域的同事討論，與供應商或動物模型資源庫聯(lián)系確定動物模型可能的來源渠道，5在最終決定動物模型前征詢實驗動物獸醫(yī)的意見。 5）實驗合作者的確定 根據(jù)實驗實施的操作，決定什么樣專長的人是需要的。在開始項目前，就確定每個人的職責和進行的工作以及資格。合理地進行人員的分工安排，參與計算、實驗設計和樣品收集對確保所得數(shù)據(jù)的有效性是十分重要的。一般一個大型研究單位的實驗動物中心設施可提供涉及本專業(yè)高技術含量的操作和昂貴裝備的服務。 2、正式設計階段 1）研究方案 針對提出的問題、研究目標和假說，進行實驗的所有操作及安排應細心地計劃和記錄在案。方案中應包括針對可控實驗變量的實驗操作、適合測定的變量參數(shù)（即得到準確測定實驗變量控制的效應）、獲得樣品和產(chǎn)生實驗數(shù)據(jù)的最適方法。項目的所有實物和數(shù)據(jù)收集和測定的時間安排表都應這時確定。 實際操作的討論包括動物模型持續(xù)的時間（慢性研究），模型中預期疾病的進程（決定測定的最適時間點），人員參加項目的時間和崗位，實驗花費。已知和潛在的危害因子也必須明確，最小危害因子風險適當預防措施也必須在方案中明確。所有實驗操作步驟應通過SOP詳細規(guī)定。 方案中還應包括數(shù)據(jù)分析的方法，如果組間差異是通過統(tǒng)計學計算而得，那么應明確所用統(tǒng)計學檢驗的方法。由數(shù)據(jù)分析對最初所提問題作出回答并接受或否決假說，由此得出結論。 2）實驗單元 研究的實體是實驗單元，可以是一個動物個體，也可以是一組動物群體。例如，當測試藥物治療和外科手術時，一個大鼠個體就是一個實驗單元，當測試環(huán)境致畸時，一整窩大鼠就是一個實驗單元。 3）實驗組別的動物只數(shù) 將適當數(shù)量的動物分配到每一個實驗組別，是實驗設計的一個重要環(huán)節(jié)。為了得到統(tǒng)計學意義的結果，每一實驗組的動物數(shù)量一般是通過預期各組間結果差異的可能程度采用特定統(tǒng)計學檢驗而決定的。一個標準籠所能容納動物的數(shù)量也是實驗組動物數(shù)量確定的實際考慮的因素。 4）對照 過多的變量（如遺傳、環(huán)境、感染因子）對動物實驗的結果產(chǎn)生影響，因此設置對照動物消除這些外來變量或可能未知的變量帶來的影響�？傊�，每一個實驗都應使用對照組動物與實驗組動物有一個直接對應的關系。對照的種類很多，包括，陽性對照、陰性對照、空白對照、媒介物對照、比擬物對照。 5）隨機化 動物分組時必須將動物隨機分配到實驗各組，以確保研究的變量在各組中不會導致偏差數(shù)據(jù)。 為達到隨機化必須在開始時將動物群體限定好。隨機化的方法常用1每一只動物有一個固定的編號，進行“暗箱”抽數(shù)，并隨機分配它們到不同組中。2利用隨機數(shù)字表或計算機隨機程序。 3、設計后階段 1）實驗操作步驟的確認 2）人員 參加研究項目的所有人員必須經(jīng)過培訓和資格認可。 3）小規(guī)模的預實驗 是使用數(shù)量少的動物得到預示性的數(shù)據(jù)，目的：1通過預實驗將操作和使用的技術固定完善，2預實驗的數(shù)據(jù)是申請資助項目方案中證明其合理性的重要依據(jù)，增加中標的機會。3估計變量參數(shù)測定的誤差，為計算樣本量提供依據(jù)。 4）數(shù)據(jù)的輸入和分析 研究者對數(shù)據(jù)的正確收集、輸入和分析負有完全的責任。當處理的數(shù)據(jù)量很大時，很容易發(fā)生數(shù)據(jù)輸入的錯誤（如組標識調換、個體標識調換），因此數(shù)據(jù)分析前，數(shù)據(jù)質量保證程序應建立并在實驗設計中包含，確保數(shù)據(jù)輸入的錯誤能及時辨別。 04 對照的設立 在實驗中設立對照組動物，是為了與實驗組動物有一個直接對應的關系，以消除過多變量和未知變量對實驗結果產(chǎn)生的影響。對照的種類有以下幾種： 1）陽性對照 陽性對照的作用是作為一個標準測量各實驗組間差異的程度，另一個是用來證明動物反應是可探測的，為實驗方法提供質量控制。 2）陰性對照 陰性對照是期望正常狀態(tài)不產(chǎn)生變化。陰性對照的目的是保證未知變量對實驗組動物引起相反的效應不存在，即排除假陽性結果。 3）空白對照 是模擬處理組過程而實際上沒有給予受試物或處理。 4）媒介物對照 在測試化合物溶于一種媒介時，這種研究要使用媒介物對照，與給測試物的方法一樣，只給予媒介物。當與非處理的對照比較時，溶媒對照將確定溶劑是否會引起什么效應。 5）比擬物對照 屬于陽性對照，用一個已知的的處理來對比待測處理。以此來確定新的藥物或處理是否有改善和提高。 05 樣本大小的確定 1、小規(guī)模預實驗 小規(guī)模預實驗設計是為了探索一個新的研究領域，確定是否能在不同的實驗條件下對研究的變量以足夠的精度測得變量值，同時檢查所要進行實驗的必備條件。由于前期資料信息的缺乏或實驗成功的可能不能肯定，有些實驗的樣本大小是無法計算的；而另一些實驗是將復雜的統(tǒng)計學設計簡化成一個重要的比較事件，此時樣本的大小應足夠大達到可以發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學意義的顯著差別。 2、預期目標成功率低的實驗 由于實驗過程成功的機會不穩(wěn)定（變數(shù)太大），這類實驗所用動物數(shù)量的計算是很困難的。 例子：通過基因插入到受精卵或ES細胞制作轉基因動物，需要大量的動物。假定所有步驟的成功率都是5%，那么用單組實驗的公式N=logß/logp，計算可得要用50只動物，如果成功率為1%，將需要300只動物，制作一個轉基因動物系。 3、驗證一個假說的正式實驗 驗證假說的實驗是常見的動物實驗類型，可以通過得到相關的一些有用信息，估算所需要的動物數(shù)量。 一般來說，有三種類型的變量可以測定 1）二分變量，一般表現(xiàn)為是/否結果的百分率，如，在某給定時間疾病或生存的發(fā)生。 2）連續(xù)變量，如某一物質在體液中的濃度或生理功能如血流速度或排尿。 3）一個事件發(fā)生的時刻，如疾病或死亡發(fā)生的時刻。這些變量數(shù)據(jù)之間的顯著性差異現(xiàn)在有許多的統(tǒng)計學方法來檢測。 一般，要知道或計算樣本大小，必須提供3或4個已知因素 1）效應大小（一般為兩組間的差別）； 2）群體標準誤差（SD，對連續(xù)性變量）； 3）測定假定效應的實驗期望力度用ß表示； 4）顯著性水平，用a表示。 前兩個因素對特定實驗是專一的，而后兩個因素一般為慣例固定的。一般來說，研究人員希望看到差別的樣本越小或群體變異性越大，觀察到顯著性差異的樣本量一定越大。 06 動物實驗中輔助變量的應用 1、輔助變量的定義 除實驗中限定或主要目的反應變量外，可以收集的其他變量的總稱，它與目的反應變量不一定有直接關系，包括被記錄但在實驗設計中不利用的變量，以及不引入到對主要實驗反應變量正規(guī)分析中的變量。但往往這些記錄的變量在實驗的分析和解釋時起到輔助的作用。 記錄所有觀察到的變量作為實驗過程的一部分，保存所有動物個體的信息作為實驗記錄的一部分是非常重要的。實際上，不能確定動物及其相關的個體信息會嚴重限制信息用于實驗的可能性。 2、輔助變量在動物實驗設計中的應用 實驗設計的主要目的一是保證所測變量的任何差異是由處理造成的，而不是其他非對照變量引起；另一個目的是通過控制確定的變量在盡可能小的范圍內，減少所測反應的變異性，這樣對處理效應的評介更準確。 1)完全隨機化化設計 完全隨機化設計依賴于用一個保證每只動物有均等可能接受任何處理的過程，將處理分配給實驗動物。處理動物的順序也應是隨機化過程的一部分，以保證所有處理動物和處理時間以及反應測量之間的差別以均等的幾率散布在所有的處理組中。只有這樣才有可能對實驗差異和可能的偏差減少到最小，從而得到可靠的結果。 但是如果實驗用的動物之間本身差別就比較大，而實驗用的動物數(shù)量又較少，那么隨機化的過程本身就可能在組間引入了不能接受的差別，導致實驗差異可能很大以至于在處理組之間不能探測到什么差別。在這個時候輔助變量（性別、體重等）的應用可以幫助我們進行組別的動物分配，達到完全隨機化想要達到的目的。 2）隨機化模塊設計 分模塊是為了控制一個或更多獨立變量，并用來指導實驗者進行一定操作的方法。這些獨立的變量可能是實驗用動物的特征（如性別、或窩仔）或是實驗的環(huán)境因素（如，籠或架上的有效空間）。實驗者可以將動物分成組（模塊），各組（模塊）內的動物盡可能在這些特征方面一致。這種分組相關特征的選定，是根據(jù)實驗者對它可能效應的知識背景而定。一般來說，社會和環(huán)境效應主要來自于群居結構，與動物的品系、年齡和性別有關，并可影響到實驗結果。 3、引入統(tǒng)計學分析的輔助變量 1）協(xié)變量分析 指那些可以測量但不容易控制又影響反應的變量。在統(tǒng)計學分析時可以采用變形的方式減少它對實驗結果的影響。例如，實驗中觀察某個指標的增加情況，可以在統(tǒng)計學分析中以增加的百分率形式進行比較，可以減少初始值差異對結果的影響。 2）多次測量 在許多實驗中動物都是天天觀察和測量。這種多次測量，實際上可以將測量的錯誤“平均掉”，從而增加分析的精確度。許多情況下，簡單地將多次測量的數(shù)據(jù)總和起來就可以了。例如，整個實驗期間動物體重的增加可將每天動物體重增加的數(shù)據(jù)總和，另一些情況，表現(xiàn)為反應線的斜率、反應峰值時間、或曲線下的面積�？傊捎枚啻螠y量，得到數(shù)據(jù)的一個完整集合形成實驗結果的一部分，并可能通過適當?shù)姆治鎏峁┫嚓P的信息。 3）多變量分析 在有些動物實驗中，每只動物測量好幾個不同的特征。例如，10個以上的血液特征參數(shù)被同時測定，在涉及基因微陣列的實驗中，在一個個體中幾千個特征要被測定，那么這時多變量分析的方法就值得去采用。 4、利用輔助變量探測局外數(shù)據(jù) 局外數(shù)據(jù)或極端數(shù)據(jù)，對分析有不利的影響，擾亂統(tǒng)計分析的結果，導致產(chǎn)生錯誤的結論。但不幸的是，對于這些數(shù)據(jù)的探測和判定和處理還沒有一個明確的解決辦法。有些局外數(shù)據(jù)是轉抄或輸入的錯誤，可以通過追查記錄更正。而有些情況下，輔助變量可以為有些局外數(shù)據(jù)的判定提供方法，幫助解釋它們產(chǎn)生的原因。如果我們作到了 1）輔助變量在實驗記錄中恰當?shù)芈?lián)系在一起；并發(fā)現(xiàn) 2）表現(xiàn)出一個或兩個明顯局外的反應（如器官重或生化檢測結果）與一只或兩只動物相關，并且相關的動物體重在整個實驗過程中與其他動物相反不升反降，那么局外數(shù)據(jù)的一個原因如感染發(fā)生就可以判定了。因此，動物體重的動態(tài)監(jiān)測和記錄常常是GLP要求的。 當局外數(shù)據(jù)被探測出來，它們應該同時從統(tǒng)計學和生物學的角度審查。首先，對實驗記錄應該進行檢查，確定這個數(shù)據(jù)是否正確，如果沒有證據(jù)證明是轉抄或記錄錯誤，那么應該將這個數(shù)據(jù)進行包括和排除兩種情況的數(shù)據(jù)分析，以了解這個數(shù)據(jù)對結論是如何影響的。如果這個值被排除，那么排除的原因應明確表明，并寫入實驗報告。 5、應用輔助變量評價隨機化過程 對實驗結果解釋的統(tǒng)計學技術，其有效性是基于每個觀察與其他觀察在統(tǒng)計學上是相互獨立的假設。這個假設就是我們常說的隨機將處理分配給動物的過程，對這個假定的違背可嚴重影響任何結果的有效性。輔助變量為評價這個假定條件的有效性提供了一個辦法。 如果隨機化過程作的很恰當，沒有其它非隨機化的因素引入，那么動物組別之間不會在不受處理影響的輔助變量方面出現(xiàn)明顯的差異。如果當非隨機化因素存在時，輔助變量的顯著性差異會表現(xiàn)出與處理效應顯著性差異相關的樣子。 6、利用輔助變量評價觀測的一致性 在整個實驗過程中，GLP和動物飼養(yǎng)規(guī)范要求在許多時間點觀察動物。這些觀察的結果應該記錄并與每只動物的實驗記錄放在一起，而且進行此項工作的人員應簽名確定，因為在每個實驗中人員的變化是存在的。一般來說，最終的觀測是對反應目標變量的測量，但是所有其他前面做的輔助變量觀測，不能被忽略，可以用來評價不同操作人員觀測的一致性，對最終反應變量的準確測定和結果解釋具有重要的意義。 7、利用輔助變量解釋實驗之間的差異 為了能使實驗獨立地進行重復，實驗的條件必須限定和清楚地描述，它必須包括實驗動物的詳細描述和至少輔助變量的總結。一些輔助變量的差別是各個實驗室之間實驗結果差別的原因，因此在進行實驗室之間結果和作這方面的解釋時，輔助變量信息的重要性就體現(xiàn)出來了。 |
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