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NanoFCMlxq

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今天分享一篇發(fā)表在 J Extracell Vesicles（2020年IF=14.98）上的文章，名為《Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications》[1]（建立一種應(yīng)用于臨床的簡化的二分尺寸排除色譜法分離細(xì)胞外囊泡）。

細(xì)胞外囊泡(EVs)是一種具有不同的生物學(xué)或病理功能的細(xì)胞來源的顆粒。根據(jù)EV的生物發(fā)生和特征，可大致分為外泌體和微囊泡(MVs)。一般來說，外泌體是直徑為30-200nm的EV，隨著多泡核內(nèi)體（MVE)的成熟在細(xì)胞內(nèi)形成。如果不考慮細(xì)胞內(nèi)的起源，與外泌體大小相似的EV可以統(tǒng)稱為小EV（sEVs）。MVE膜與細(xì)胞質(zhì)膜融合后，可以釋放外泌體。與外泌體不同，MV是較大的EV，典型的直徑在500~1000nm之間。MV主要是通過質(zhì)膜的直接出芽，在細(xì)胞外釋放而形成的。然而，EV往往有更為復(fù)雜的亞群體。例如，Kowal等通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)從人樹突狀細(xì)胞分離的不同EV亞型有共同的生物標(biāo)記物如flotillin和熱休克70kda蛋白質(zhì)(HSP70)，同時也有一組五種蛋白質(zhì)在不同的人群種有不同的相對豐度。所有EV亞群之間的功能差異和特征尚不清楚。但是，人們普遍認(rèn)為EV在各種人類疾病的診斷、預(yù)后和治療方面具有重要價值，因為它們攜帶組織和/或器官衍生的生物分子，如蛋白質(zhì)、RNA、DNA和脂質(zhì)。

EV生物標(biāo)志物的研究面臨著許多挑戰(zhàn)，特別是在將分離和鑒定方法標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用于臨床方面。此外，樣本收集、存儲、分析方法和樣本量在任何EV生物標(biāo)志物的驗證階段都具有重要意義。正如MISEV2018和國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(ISEV)的其他立場文件所說，分離純化EV是在后續(xù)分析之前最重要和最困難的先決條件之一。特別是從復(fù)雜體液中分離EV往往處于純度和易于操作之間的兩難境地，這對現(xiàn)實臨床應(yīng)用都至關(guān)重要。在30多種生物樣本中，血漿/血清是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和疾病診斷中使用最廣泛的樣本類型之一。然而，血漿/血清中存在多種生物分子或生物納米顆粒的大小和密度與EV相似，主要包括脂蛋白、亞細(xì)胞器、細(xì)胞碎片和病毒顆粒。其中，低/極低/高密度脂蛋白(LDL、VLDL、HDL)是EV分離中最常見的污染物之一，因為血漿中有～10^16脂蛋白/ml。MISEV2018建議可以分析幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記物，以證明EV純度，包括那些能證明EV存在的標(biāo)志物，以及在共同分離時污染物的消耗。此外，蛋白質(zhì)單位顆粒比（顆粒/蛋白質(zhì)比）也是估算EV純度的一個重要參數(shù)。此外，Tian等人報道了另一種間接的方法，通過使用納米流式檢測技術(shù)(nFCM)將TritonX-100可破壞的顆粒與總顆粒的比例來估算EV純度。

目前人們認(rèn)為，超速離心法(UC)，特別是密度梯度離心法是最被接受的高純度EV分離方法之一。但UC不能很容易地用于醫(yī)學(xué)實驗室，因為它往往耗時，顆粒回收率低，需要大型儀器。在這里，將粒子回收率定義為回收粒子與輸入粒子的比值�；谶^濾或沉淀的方法可能會遭受嚴(yán)重的蛋白質(zhì)污染或引入外源性化學(xué)物質(zhì)。相比之下，尺寸排除色譜(SEC)提供了一個重要的選擇，不需要大型儀器，同時分離純度與UC相當(dāng)。

SEC使用聚合物在柱中形成多孔固定相，允許不同大小的顆粒通過重力流或使用液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行差異洗脫。雖然已知乳糜微粒、LDL和VLDL不能完全去除，但SEC可以有效地將EV從白蛋白等體液中大多數(shù)高含量的蛋白質(zhì)污染中分離出來。

大多數(shù)SEC分離EV的研究需要收集大約26個洗脫餾分，部分餾分可合并用于EV分析。事實上，對于臨床應(yīng)用，我們認(rèn)為使用重力流SEC進(jìn)行EV分離的簡化方案具有顯著的需求。為了解決這個問題，需要評估SEC的三個方面。首先，需要充分的解決樹脂的選擇問題。交聯(lián)(CL)瓊脂糖基材料是EV分離中最常用的SEC樹脂之一，然而，這些材料尚未得到充分的比較。其次，應(yīng)對EV分離時的柱體積進(jìn)行優(yōu)化。10ml的柱體積是SEC中最常用的設(shè)置，而對于具有相同內(nèi)徑的柱，已有研究表明，增加柱體積可能有更好的分離性能。但是，到目前為止，據(jù)我們了解，重力流柱還沒有得到驗證，至少根據(jù)同行評審的出版物。第三，采用上述樹脂和柱體積組合，分離方案應(yīng)盡可能簡單，即使是實驗室醫(yī)學(xué)培訓(xùn)不足的人員也可以操作。

本研究逐步解決了上述三個問題，如圖1所示。比較了所有三種瓊脂糖CL樹脂，即CL-2B、CL-4B和CL-6B的性能，然后進(jìn)行了柱體積優(yōu)化。在這些優(yōu)化的條件下，我們證明了2個批量洗脫步驟的二分式SEC分離足以從胎牛血清(FBS)、人血清(HS)和無FBS細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離EV，具有高純度和顆�；厥章�。這種簡化的EV分離方法具有潛在的用于臨床的優(yōu)勢。

材料和方法：

一、FBS

FBS（批次#：2014014）購自BI，在室溫下300×g離心10min，在4?C下17000×g離心20min以清除碎片。上清液用0.22μmMinisart高流量PES注射器過濾器過濾，并在-80?C保存。

二、人血清(HS)

本研究采集的人類血液樣本已獲得暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。包括4名健康捐贈者（3名女性，1名男性，年齡24-32歲，正常飲食）。供體1的樣品用于評價不同樹脂和柱體積的性能，以及SEC和UC的蛋白質(zhì)組學(xué)比較。采用供體2-4的血清進(jìn)行二分法SEC方法的驗證。對于每個捐贈者，使用22號針和無添加劑的真空采血管從肘正中靜脈或基底靜脈抽取外周血。血樣在室溫下直立1-1.5h，以便凝血。然后按照上面描述的FBS的處理方法處理血樣。

三、SEC柱的填充和平衡

SEC柱在使用前一天進(jìn)行填充。瓊脂糖CL-2B、CL-4B或CL-6B樹脂通過輕輕翻轉(zhuǎn)2min以上徹底重懸。為了制備柱體積分別為10ml和20ml的SEC柱，分別將13.5ml和27ml樹脂分別裝入Econo-Pac色譜柱。準(zhǔn)備好柱，并在4?C下保持靜止過夜，使樹脂沉淀并達(dá)到每重力指定的柱體積。在EV分離之前，在柱的頂部添加了帶有Econo-Pac色譜柱的上層床支撐，以防止其被干擾或干燥。然后在進(jìn)行樣品加載前，用2倍的PBS(0.22μm過濾，以下同)平衡柱。收集從SEC柱中滴出的最后1mlPBS，用于檢測背景顆粒和蛋白質(zhì)。

四、用常規(guī)SEC分離EV

HS和FBS樣品在室溫下解凍，然后在4?C下以17000×g，10min離心，以去除凍融過程中產(chǎn)生的聚集體。然后將上清液裝入SEC柱中。將1ml的樣品裝載在平衡的SEC柱的頂部，以使其通過重力流完全滴出。分餾時，每個餾分加入500μlPBS，并收集洗脫液。前500μlPBS洗脫的洗脫液計算為分?jǐn)?shù)1。10ml和20ml柱分別收集26和52個餾分。所有餾分均存儲在-80?C下，用于下游分析。

五、二分式SEC分離EV

在樣品（1ml）完全滴出柱之后，立即用不同組合的PBS進(jìn)行2次洗脫（7.5ml和18.5ml，8ml和818ml，8.5ml和17.5ml，9ml和17ml，或9.5ml和16.5ml）。樣品流和第一次批量洗脫的洗脫液作為洗脫液1。然后收集第二次批量洗脫液作為洗脫液2。洗脫液1和2分別使用具有30kDa分子量切斷(MWCO)膜的過濾器Amicon Ultra-4過濾器，通過5000×g和35?固定角轉(zhuǎn)子離心濃縮。

六、SEC柱的清洗和恢復(fù)

為了評估重復(fù)使用的柱的性能，我們按照GE醫(yī)療公司提供的瓊脂糖樹脂進(jìn)行了柱清洗和恢復(fù)。使用的SEC柱用2×柱體積的清洗液清洗，然后用2×柱體積的PBS洗滌進(jìn)行恢復(fù)。下次使用時，應(yīng)用1×柱體積的PBS重新平衡。

七、納米顆粒跟蹤分析(NTA)

顆粒大小和濃度由NanoSight NS300分析儀確定，配備488nm藍(lán)色激光和sCMOS相機(jī)。樣品用PBS稀釋≥20倍，然后裝入儀器。對每個樣本，采集3個隨機(jī)視角的視頻，儀器參數(shù)設(shè)置如下：溫度控制器，on；溫度，25?C；攝像機(jī)水平，14；捕獲持續(xù)時間，60s。視頻采用以下參數(shù)進(jìn)行分析：粘度、水（0.89cP）；檢測閾值，3。使用NanoSight NTA3.4軟件(Malvern)報告了從3個視頻中計算出的粒徑和平均濃度。

八、透射電子顯微鏡(TEM)

用等體積的4%的多聚甲醛固定從供體3的HS(w/v)中分離出的洗脫液1的20μl。10μl的固定樣品被一個formvar碳涂層的TEM網(wǎng)格吸收，然后再用1%（w/v）戊二醛固定。柵格用醛酸鈾酰溶液(4%醋酸鈾酰，0.0075M草酸，pH7)染色，并在甲基纖維素-ua（0.4%醋酸鈾酰，1.8%甲基纖維素）中干燥。最后，用TecnaiG2透射電子顯微鏡在100kV下觀察網(wǎng)格。

九、 蛋白[質(zhì)]印跡法

通過BCA蛋白測定法(Thermo)測定蛋白濃度。對于從常規(guī)SEC樣本中獲得的多個餾分的IB，采用兩種樣本加載策略。對于含有足夠蛋白質(zhì)的組分，裝載20μg蛋白。對于每32μl蛋白小于20μg的組分，使用32μl的樣品。所有樣品分別用PBS調(diào)整到體積為32μl，然后加入8μl的5×上樣緩沖液。煮沸10min后，將樣品裝入NuPAGE10%Bis-Tris凝膠(1.5mm×15孔，Thermo)中。在1×NuPAGEMOPSSDS運(yùn)行緩沖液(Thermo)中，在200V下進(jìn)行35min的電泳，然后在1×NuPAGE轉(zhuǎn)移緩沖液(Thermo)中，以20V常數(shù)下進(jìn)行PVDF膜(Thermo)轉(zhuǎn)移1小時。用5%的牛奶和含0.2%Tween的Tris緩沖鹽水(TBST)封閉膜，并與一抗在4?C下孵育過夜。一抗包括rabbit anti-apolipoprotein A-I/ApoA1 pAb、rabbit anti-integrin β3 mAb、rabbit anti-syntenin mAb、rabbit anti-TSG101 mAb、 rabbit anti-CD9 mAb、rabbit anti-CD63 mAb、rabbit anti-albumin mAb、 mouse anti-ApoB mAb。二抗染色時，用TBST洗滌膜3次(每次5min)，并與二抗在室溫下孵育1h。HRP偶聯(lián)的二抗包括抗兔IgG和抗小鼠IgG。最后，在用Clarity Western ECL Substrate孵育之前，用TBST洗滌膜3次(每次5min)。圖像拍攝是使用590nm濾光片的5200 Multi imager。

對于二分式SEC中洗脫1和洗脫2上的IB，考慮到目標(biāo)蛋白的豐度，分別裝載5、10、20或30μg蛋白/通道。采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色分析，驗證根據(jù)BCA結(jié)果計算出的相同量蛋白的負(fù)載。

十、SW620細(xì)胞培養(yǎng)上清液的二分式SEC實驗

SW620細(xì)胞在cDMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，包含10%胎牛血清、1mM丙酮酸鈉、1%青霉素/鏈霉素和10μg/ml環(huán)丙沙星。為了制備用于EV分析的上清液，將SW620細(xì)胞接種于1.5×10^7個細(xì)胞/燒瓶中，培養(yǎng)48h。用PBS在瓶中洗滌2次，用DMEM沖洗，然后在10mlDMEM中培養(yǎng)24h，讓EV分泌。然后收集上清，用GL-21M離心機(jī)在220×g10min和15000×g離心30min，分別去除細(xì)胞和碎片。用0.22μm過濾器過濾后，使用30kDa MWCO超濾(UF)裝置將上清液濃縮至～1ml。制備21個含～210ml上清液的燒瓶，用于EV實驗，包括顆粒和蛋白濃度、IB和EV純度的測定。

十一、SW620細(xì)胞的熒光標(biāo)記

在熒光標(biāo)記實驗中，8個75cm2燒瓶的貼壁細(xì)胞用PBS洗滌兩次。最后在PBS中加入濃度為5μM5（6）-羧基熒光素-N-琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)，每1×10^7細(xì)胞/1ml。對于未標(biāo)記的組（8個燒瓶），使用PBS模擬CFDA-SE標(biāo)記。然后將燒瓶在37?C下孵育10min。然后加入5×體積的cDMEM終止染色。用PBS在瓶中洗滌2次，用DMEM沖洗，然后在10mlDMEM中培養(yǎng)24h，使EV分泌。然后用上述相同的程序制備用于EV分析的上清液。

十二、nFCM分析

采用nFCM(NanoFCM)分析，評估顆粒大小、熒光強(qiáng)度和EV純度。由于EV將被TritonX-100裂解，EV純度可以通過TritonX-100破壞粒子占總粒子的比例間接反映。采用含有68nm、91nm、113nm和155nm二氧化硅球的混合物（S16M-Exo，NanoFCM）作為粒徑標(biāo)準(zhǔn)品。將SW620 EV與TritonX-100混合，最終濃度為1%(v/v)，并在冰上放置1h。然后將稀釋后的樣品與等量的1%(v/v)FITC標(biāo)記的作為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)的250nm二氧化硅納米球混合。nFCM分析的儀器參數(shù)設(shè)置如下：激光，10mW，488nm；SS衰減，10%；采樣壓力，0.8kPa；采樣周期，100μs；記錄時間，1min。

十三、熒光測量

對CFDA-SE標(biāo)記和未標(biāo)記的SW620細(xì)胞的培養(yǎng)上清液進(jìn)行二分式SEC檢測。洗脫液1和洗脫液2分別通過UF濃縮至100μl。將70μl的濃縮洗脫液1或洗脫液2裝入96孔板中。熒光強(qiáng)度(FI)使用Victor X5 multilabel plate reader(PerkinElmer)進(jìn)行測量。樣品用488nm激光激發(fā)，發(fā)射光通過535/25nm帶通濾光片記錄。

十四、EV的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

無血小板血漿（PFP）、超速離心沉淀(UF)、蛋白質(zhì)提取物、蛋白消化、數(shù)據(jù)獨(dú)立采集質(zhì)譜法(DIA-MS)、數(shù)據(jù)庫搜索和蛋白質(zhì)定量，內(nèi)容略。

十五、基因本體分析

十六、數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計

結(jié)果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻(xiàn)具體看，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻(xiàn)：

[1]Guo, J; Wu, C; Lin, X; et al.Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.[J].J Extracell Vesicles.2021,10(11):e12145

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你們是什么方法純化？

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磁珠型，操作簡單，外泌體濃度高，2個小時就能完成純化。

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38樓2022-02-14 10:59:44
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40樓2022-02-14 17:17:49
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