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[資源]
MSC細胞培養(yǎng)說明
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臍帶間充質干細胞是一種能分化成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞的多能干細胞。其具有強大的增殖能力，且參與構成造血微環(huán)境，因此被廣泛應用于組織工程，細胞治療和基因治療。 操作指南 常見問題 許多科研小伙伴，在培養(yǎng)MSC細胞時，可能會遇到一些問題，在這里小逸為大家梳理一下 MSC細胞培養(yǎng)操作指南 希望對老師們有所幫助（有需要采購可以看本人介紹） 產品參數(shù) 01 MSC細胞基本信息 MSC人臍帶間充質干細胞 名稱：MSC人臍帶間充質干細胞 來源：臍帶 特性：貼壁生長 形態(tài)：梭形細胞樣 來源：IMMOCELL 支原體：無 推薦傳代比例：1:3至1:5 推薦換液頻率：2~3次/周 凍存液：無血清凍存液，液氮儲存 規(guī)格：5x10^5cells/T25 培養(yǎng)條件氣相：95%空氣+5%二氧化碳；溫度：37℃ MSC細胞培養(yǎng)基 人臍帶間充質干細胞 完全培養(yǎng)基 流式鑒定&三系分化結果圖 MSC細胞流式鑒定結果圖 成脂 成骨 成軟骨 到貨處理 02 MSC細胞收貨處理 復蘇細胞T25瓶 復蘇MSC細胞 1.收到MSC細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生及時和我們聯(lián)系； 2.用75%酒精消毒瓶壁，將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置2-4h，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)； 3.給收到的細胞拍照(10x,20x)各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細胞需要售后時提供收到細胞時細胞狀態(tài)的依據。 收貨注意事項 1.如果使用培養(yǎng)瓶，在將其放入培養(yǎng)箱前，應將封口膜去掉，瓶蓋旋松，以便進行充分的氣體交換 2.仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致 培養(yǎng)指南 03 MSC細胞培養(yǎng)操作說明 ►►► MSC細胞復蘇步驟 將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。 第二天換液并檢查MSC人臍帶間充質干細胞密度。 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng) ►►► MSC細胞傳代操作 如果MSC細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng) a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。 b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 min（視細胞情況而定），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若MSC人臍帶間充質干細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。 c、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ►►► MSC細胞凍存步驟 待MSC細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例 1.收集MSC人臍帶間充質干細胞，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，然后進行細胞計數(shù)。 2.根據細胞數(shù)量對應加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×10^6~1×10^7/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。 3.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。 ►►► 溫馨小貼士 1.為防止回收培養(yǎng)基時操作造成污染，運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）建議不再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞 2.收到細胞后第一次傳代建議1：2傳代 常見問題 1、何時須更換培養(yǎng)基 視細胞生長密度而定，常規(guī)細胞2-3天更換培養(yǎng)基。 2、何時進行傳代 細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng) 首次傳代建議1：2傳代，就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。 3、細胞凍存濃度是多少 1*10^6-1*10^7之間都可以。 4、凍存細胞數(shù)量計算 如果是有要求每管要凍多少細胞，那就用1ml完培重懸后，取部分按平時方法計數(shù)，剩下的細胞按計數(shù)需要的細胞量凍存即可 如果沒要求，那就按平時，一個皿凍一管。 5、可否使用與原先不同培養(yǎng)基 不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應，易造成細胞狀態(tài)不好，最終造成細胞無法存活。 6、可否使用與原先不同血清種類 不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。 7、影響細胞長得慢因素 A.沒有保證密度，細胞長不起來 B.操作時力度沒控制好，將細胞吹碎，狀態(tài)變差 C.血清質量不好，影響細胞生長 8、貼壁不牢的細胞到貨處理流程 A：到貨后先穩(wěn)定4-6小時 將培養(yǎng)瓶內全部培養(yǎng)基收集到50ml管內，再用pbs潤洗，pbs也收集到50ml管中。將上述上清1000rpm離心3min后，去上清，加入pbs重懸細胞沉淀。1000rpm離心3min后，去上清，加入胰酶1-2ml，重懸細胞沉淀，靜置1-2min，加入2-4ml完培終止消化1000rpm離心3min后，將細胞鋪到新的6cm皿或T25瓶中，鏡下觀察如有成團細胞，輕輕吹開即可。 B：T25瓶內貼壁細胞按正常步驟操作收集細胞即可。將A和B都一起鋪到同一個皿里搖勻后，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 |
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