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逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，為何要滅活逆轉(zhuǎn)錄酶？
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invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄疑問(wèn)： 1. 程序上的問(wèn)題。37℃ 2min→25℃ 10min→37℃ 50min。 中間這個(gè)25℃是起什么作用？ 2. 反應(yīng)結(jié)束后為何要70 ℃，15分鐘將逆轉(zhuǎn)錄酶滅活。 3.逆轉(zhuǎn)錄這一步的的成分里面哪些東西會(huì)影響后續(xù)的 qPCR? |
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一般逆轉(zhuǎn)錄時(shí)用的隨機(jī)引物才會(huì)25度。逆轉(zhuǎn)錄酶特別是mmlv還有末端轉(zhuǎn)移酶活性，可能會(huì)在合成的cDNA末端添加堿基c詳細(xì)可以參考smart。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的離子，殘留引物都可能影響后續(xù)擴(kuò)增，所以一般下一步做PCR的話，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物最好不要超過(guò)PCR反應(yīng)體系十分之一。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
2樓2022-10-01 23:21:06
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關(guān)于要滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性還有一個(gè)重要原因可能是RT競(jìng)爭(zhēng)性抑制DNA pol，推測(cè)是影響DNA pol結(jié)合到cDNA模板。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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反對(duì)派3樓2022-10-02 08:42:27
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4樓2022-10-02 12:18:41
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5樓2023-01-07 11:43:47
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