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johnnyhuang鐵蟲 (初入文壇)
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植物總DNA的提取方法
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植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ提取法： 1 稱取新鮮葉片2-3ｇ,剪碎放入研缽中,在液氮中研磨成粉末。2 將粉末轉(zhuǎn)移到的加有7ｍｌ經(jīng)預(yù)熱的1 5×ＣＴＡＢ提取緩沖液15ｍｌ離心管中,迅速混勻后置于65℃水浴中,溫育30ｍｉｎ。3 取出離心管,冷卻至室溫,加入氯仿/異戊醇(24:1),充分混勻,室溫下2300×ｇ離心20ｍｉｎ。4 將上清轉(zhuǎn)移至另一新的15ｍｌ離心管中,加入1/10體積10%的ＣＴＡＢ和等體積的氯仿/異戊醇。充分混勻,2300×ｇ離心20ｍｉｎ。5 轉(zhuǎn)移上清至另一新的15ｍｌ離心管中,加入等體積1%的ＣＴＡＢ沉淀緩沖液,輕輕搖晃至形成ＤＮＡ絮狀沉淀。1000×ｇ離心10ｍｉｎ,使ＤＮＡ沉淀于管底。6 加入1 5-2ｍｌ的1ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ及5μｌＲＮａｓｅ置于56℃水浴中過夜。待ＤＮＡ完全溶解后,加2-3ｍｌ4℃預(yù)冷的95%的冰乙醇使ＤＮＡ沉淀,挑出ＤＮＡ,置于1 5ｍｌ離心管中,用70%乙醇清洗30ｍｉｎ,用離心機甩5ｓ,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5ｍｉｎ,倒出95%乙醇,在超凈工作臺上吹干。7 將風(fēng)干的ＤＮＡ直接在4℃保存?zhèn)溆没蛉苡?00μｌＴＥ溶液中于-20℃保存。 植物ＤＮＡ的ＳＤＳ提取法： 1 取2-3ｇ新鮮葉片,在液氮中研磨成粉狀(防止溶化)后轉(zhuǎn)入15ｍｌ離心管中。2 加入5ｍｌ于65℃預(yù)熱的提取緩沖液,65℃水浴保溫30ｍｉｎ(搖動數(shù)次),使提取液與樣品充分混合。3 加入2ｍｌ5ｍｏｌ/ＬＫＡｃ,劇烈振蕩,冰浴保溫20ｍｉｎ以上。4 2700×ｇ離心20ｍｉｎ,將上清液倒入新的15ｍｌ離心管中,(若提�。模危劣糜冢樱铮酰簦瑁澹颍畹葘嶒�,一般在轉(zhuǎn)移上清時加濾膜,防止樣品殘渣混入,可保證ＤＮＡ純度)。5 加入4ｍｌ氯仿/異戊醇(24∶1),搖勻,平衡,2700×ｇ離心15ｍｉｎ。6 在另一新的15ｍｌ離心管中加入5ｍｌ預(yù)冷的異丙醇,將上清液用移液槍轉(zhuǎn)入此管,在-20℃冷卻30ｍｉｎ以上。7 2700×ｇ離心10ｍｉｎ,棄去上清液,用4ｍｌ70%乙醇洗滌,室溫保持10ｍｉｎ。2700×ｇ離心3ｍｉｎ,倒去上清液。8 重復(fù)步驟7,用4ｍｌ70%乙醇洗滌,室溫保持10ｍｉｎ。2700×ｇ離心3ｍｉｎ,倒去上清液。超凈工作臺內(nèi)吹干(3ｈ左右)。9 加1ｍｌＴＥ緩沖液中溶解,加10μｌＲＮａｓｅ(10ｍｇ/ｍｌ),在37℃恒溫箱中溫育20ｍｉｎ。10 再加100μｌ3ｍｏｌ/ＬＮａＡｃ和2ｍｌ無水乙醇,2700×ｇ離心3ｍｉｎ,倒去上清液。超凈工作臺內(nèi)吹干(3ｈ左右)。11 將ＤＮＡ沉淀溶于150μｌＴＥ中,置于超凈工作臺內(nèi)(3ｈ左右)。將ＴＥ溶液轉(zhuǎn)入已滅菌的1 5ｍｌｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中,-20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 植物ＤＮＡ的“一管法”提取方法： 1 稱取100ｍｇ新鮮植物組織,剪碎置于1 5ｍｌ離心管中,可加入少許無菌石英砂,加入3滴提取緩沖液,用帶玻璃鉆頭的電鉆充分研磨勻漿。2 加入400μｌ提取緩沖液,混勻后置于90℃水浴中,不時顛倒搖勻。3 溫育20ｍｉｎ后,置于冰浴中5ｍｉｎ,使組織和聚乙烯聚吡咯烷酮(ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ,ＰＶＰＰ)沉淀,置于4℃下保存?zhèn)溆谩?br /> 適用于ＰＣＲ研究的快速提取法： 1 田間剪取植株新鮮葉片5-10ｍｇ(約2ｃｍ長)左右,新鮮葉片放于1 5ｍｌ離心管中,存于冰盒中,根據(jù)樣品號貼上相應(yīng)的標(biāo)簽。2 用剪刀將葉片組織剪細(xì)(約0 5ｃｍ長)放在點穴式研板中。3 加入400μｌＤＮＡ提取緩沖液,用玻棒將葉組織研細(xì),直到液體變成深綠色即可。4 再加400μｌＤＮＡ提取緩沖液,混合均勻,轉(zhuǎn)入一新的1 5ｍｌ離心管(貼上相應(yīng)的編號)。5 加400μｌ氯仿,混合均勻后,2400×ｇ離心30ｓ,將上清液轉(zhuǎn)入一支新的1 5ｍｌ離心管(貼上相應(yīng)的編號)。6 加800μｌ無水乙醇,混勻,2400×ｇ離心3ｍｉｎ。棄上清。7 70%乙醇沖洗,風(fēng)干。8 用50μｌＴＥ緩沖液溶解,存于-20℃。9 取1μｌ用于ＰＣＲ分析。 棉花等酚類、多糖類物質(zhì)較多的植物ＤＮＡ提取法： 1 取2ｇ新鮮幼嫩的葉片放入研缽中,加入液氮后快速、充分研磨,待成極細(xì)的粉末狀時迅速轉(zhuǎn)入到50ｍｌ離心管中。2 在50ｍｌ離心管中加入10ｍｌ冰預(yù)冷的提取緩沖液,在渦懸振蕩器上充分混勻。3 于4℃,2700×ｇ離心20分鐘,倒去上清液。4 在沉淀中加入5ｍｌ裂解緩沖液,在渦旋振蕩器上充分混勻。5 于65℃水浴鍋中溫育30ｍｉｎ。6 加入5ｍｌ氯仿/異戊醇(24/1),并上下翻轉(zhuǎn)以充分混合。7 于4℃,2700×ｇ離心5分鐘。8 轉(zhuǎn)移上層水相至一新的50ｍｌ離心管中。9 重復(fù)步驟7-9一次。10 加入2/3體積的冰預(yù)冷的異丙醇,并上下翻轉(zhuǎn)以充分混合,至-20℃2ｈ。11 于4℃,1200×ｇ離心10ｍｉｎ。12 在一新管中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液,用玻棒將ＤＮＡ轉(zhuǎn)入該管(如不能直接用玻棒纏出,可離心后倒出上清,再在其中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液),放置20ｍｉｎ后稍許離心,移走上清并吸出殘存乙醇,室溫干燥。13 加入1 0ｍｌＴＥ(10ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌＰＨ=8 0,1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ)并加入終濃度為20(ｇ/Ｌ的ＲＮａｓｅＡ,過夜。14 風(fēng)干,用50μｌＴＥ緩沖液溶解,存于-20℃?zhèn)溆谩? |
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2樓2005-12-27 15:11:36
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