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病毒RNA提取實驗方法（protocol）
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蟲蟲們，看著好的就頂一下。 今天找到不少好東西，全給大家發(fā)上來。  病毒RNA提取實驗方法（protocol） 1，用異硫氰酸胍提取 提禽流感病毒的詳細步驟，可參考（我提過N次做定量PCR都沒問題）： 1.取200ul樣品數(shù)+陰性對照+陽性對照個1.5ml滅菌eppendorf管 2.加600ul異硫氰酸胍，然后加入對照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻 3.13000rpm離心15min 4.在第3步離心快結(jié)束時，另取同樣多eppendorf管，加入400ul -20度預(yù)冷的異丙醇 5.取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結(jié)束往外拿的時候，管子盡量不要傾斜）轉(zhuǎn)移到第4步準備的管中，顛倒混勻 6.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體 7.加600ul 75％乙醇，顛倒數(shù)次以洗滌殘存異丙醇 7.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體 8.4000rpm離心10sec，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫干燥2－3min（不可過分干燥，防止下一步RNA不溶解） 9.加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ詈?小時內(nèi)使用，以免RNA降解） 2，用TRIzol LS提取 應(yīng)用TRIzol LS提取病毒RNA 所提取物為血清、血液、細胞培養(yǎng)液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時盡量在人少時進行，防止空氣中RNA酶的污染。所用一切物品也應(yīng)是無RNA酶的。 1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混勻，室溫放置10min。 1.2 加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管（溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現(xiàn)象），室溫放置10min （由于氯仿沸點低、易揮發(fā)，振蕩時離心管可能爆開，小心）。 1.3 離心 4℃、13000r/min、15min，取上層液相移入另一管（切忌吸動白色中間相）。 1.4 加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min。 1.5 離心 4℃、13000r/min、15min，（這時乍一看會發(fā)現(xiàn)管子里好像沒有東西，再仔細看看，會發(fā)現(xiàn)靠近管底的壁上有一星點的白色沉淀物，就是它了）用槍小心吸去所有上清。 1.6 1ml75%乙醇洗一遍，離心 4℃、8000r/min、10min，（這時又會發(fā)現(xiàn)管子沒東西了，不要擔心，有的，但是因為量太少看不見罷了）用槍小心吸去所有上清，在超凈臺中干燥5min。 1.7 加入適量DEPC處理水。（如果材料來源豐富的話，加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量；若要省著點用，則自己看著辦了，盡量不要加太多的水）。 1.8 建議立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后凍存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后則只能在－20℃保存1個月左右。 3，Trizol法提禽流感病毒protocol Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。 1、 取雞胚尿囊液，加入5-10倍體積 Trizol液，混勻； 2、 室溫放置5分鐘，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒； 3、 取上層水相于一新的離心管，按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘； 4、 棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混勻，4℃下7500g離心5分鐘； 5、 重復(fù)第4步； 6、 小心棄去上清液，然后室溫干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度； 7、 然后將RNA溶于水中，放置10分鐘。 [注意] 1、 整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。 2、 加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年 |
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