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【分享】ELISA法測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)
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1、實(shí)驗(yàn)原理 ELISA 是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。免疫酶技術(shù)是將酶標(biāo)記在抗體/抗原分子上，形成酶標(biāo)抗體/酶標(biāo)抗原，稱為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無(wú)和深淺，定位或定量抗原/抗體。ELISA 法是免疫酶技術(shù)的一種，其特點(diǎn)是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板(或球)吸附抗原/抗體，使之固相化，免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)都在其中進(jìn)行。在每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌，這既保證了反應(yīng)的定量關(guān)系，也避免了末反應(yīng)的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA 法中。酶促反應(yīng)只進(jìn)行一次，而抗原、抗體的免疫反應(yīng)可進(jìn)行一次或數(shù)次，即可用二抗(抗抗體)、三抗再次進(jìn)行免疫反應(yīng)。 目前常用的幾種ELISA 方法有：測(cè)定抗體的間接法，測(cè)定抗原的雙抗體夾心法和測(cè)定抗原的競(jìng)爭(zhēng)法等。本實(shí)驗(yàn)采用間接法測(cè)定單克隆抗體效價(jià)。其主要過(guò)程為：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應(yīng)板的凹孔內(nèi)，加待測(cè)抗體，保溫后洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì)，加酶標(biāo)抗抗體，保溫后洗滌，加底物保溫30分鐘后，加酸或堿終止酶促反應(yīng)，用目測(cè)或光電比色測(cè)定抗體含量。 2、儀器、原料和試劑 儀器 聚苯乙烯96孔酶標(biāo)板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。 原料 單克隆抗體 試劑 1、 抗原及酶標(biāo)記抗體 ①抗原：兔抗人IgG(Rabbit Aanti-human IgG，Code No．A0423)； ②酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP，Code No．P0260)；均為DAKO 公司產(chǎn)品，使用時(shí)按照說(shuō)明書(shū)要求稀釋。 4、 洗滌液(含0.05％Tween 20的PBS)：1LPBS 中加入Tween-20 500μL. 5、 封閉液(含1％牛血清白蛋白，0.1％Tween 20的PBS)：10mLPBS 中加入100mgBSA，10μLTween-20. 6、 底物溶液 ①磷酸鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0)：稱Na2HPO4•12H2O2.2g，NaH2PO4•2H2O 6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL. ② TMB 貯液：稱60mgTMB 溶于10mL 二甲基亞砜中，4℃避光保存。 ③底物應(yīng)用液：現(xiàn)用現(xiàn)配，磷酸鈉緩沖液10mL，TNB 貯液10μL.30％H2O2 15μL，混勻。 7、 終止液：2mol/LH2SO4 四、操作步驟 ①抗原包被：兔抗人IgG 作為抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板 中。4℃放置過(guò)夜。 ②洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次。 ③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h. ④洗滌：用洗滌液洗3次。 ⑤加待測(cè)樣品(一抗)：將含單克降抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清在另-塊板上用PBS 連續(xù)稀釋(按照1：2或1：10)，100μL /孔加到已包被的板上，每個(gè)樣品平行做兩份，PBS 或空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，已知樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h. ⑥洗滌：用洗滌液洗3次。 ⑦加酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP，用封閉液l ：8000稀釋，100μL／孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。 ⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。 ⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍(lán)色。 ⑩終止反應(yīng)、比色：加50μL/孔終止液。顏色變黃；用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm 處各孔的吸光值，陽(yáng)性反應(yīng)的最大稀釋度為待測(cè)樣品的效價(jià)。 |
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8樓2014-10-27 15:20:47
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2010-08-03 16:04
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