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【原創(chuàng)】細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)自己的總結(jié)
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貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)相關(guān)技術(shù) （一）器材設(shè)備 培養(yǎng)瓶，吸管，橡皮頭，離心管，廣口瓶，濾器（大小），針管，凍存管，高壓消毒器，培養(yǎng)箱，無菌工作臺，CO2氣罐，相差倒置顯微鏡，4℃冰箱，20℃冰箱，pH調(diào)節(jié)儀 （二）試劑配制 1）培養(yǎng)基的配制 使用前，加入小牛血清，使其濃度為10% 2）PBS配制（1000ml） NaCl 8.5g KCl 0.2g Na2HPO4•12H2O 2.85g KH2PO4 0.27g 上述試劑稱量后加入800ml雙蒸水中，攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)pH=7.2，用1000ml量筒定容，過濾除菌，4℃保存 3）胰酶配制 配制PBS液體100ml，0.25g胰酶（粉劑），EDTA 0.02g 加入其中，攪拌至完全溶解（約4小時，期間放入4℃冰箱一次，全程冰袋保護），調(diào)節(jié)pH=7.5，然后放入冰箱4℃過夜，次日過濾（或次日再調(diào)pH值過濾） 4）抗生素配制 80萬單位青霉素+4ml PBS 100萬單位鏈霉素+5ml PBS后取出4ml加入上述青霉素液中，充分混合之后，8ml液體分裝，-20℃保存，每99ml培養(yǎng)基中加入青鏈霉素混合液0.1ml，其終濃度青霉素100u/ml；鏈霉素100ug/ml 5）凍存液配制 DSMO加入小牛血清，DSMO濃度為10%；注意，DSMO要避光保存。 （三）操作步驟 準(zhǔn)備工作 試劑的準(zhǔn)備（見試劑配制部分） 設(shè)備及器材的準(zhǔn)備 確保操作臺潔凈，所用物品經(jīng)過高壓或者其他方式消毒 細(xì)胞復(fù)蘇 1. 將凍存的細(xì)胞取出后迅速放入37℃水浴中，并不時搖動，在一分鐘內(nèi)使其完全融化 2. 將細(xì)胞吸出放入有培養(yǎng)基的離心管中中，用滴管輕輕吹打混勻，800轉(zhuǎn)/min，5分鐘離心；棄去上清液，加入培養(yǎng)基，混勻再離心一次，棄液，加入4~5ml 培養(yǎng)基，混勻，移入培養(yǎng)瓶中 細(xì)胞換液 1. 用舊液體輕輕沖洗培養(yǎng)瓶底，然后用滴管吸盡舊液（棄去） 2. 加入PBS1~2ml，輕輕搖晃，然后用滴管吸盡舊液（棄去） 3. 如果細(xì)胞液比較臟，可以重復(fù)步驟2 4. 加入新培養(yǎng)基，輕輕搖勻，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 細(xì)胞傳代 1. 用舊液體輕輕沖洗培養(yǎng)瓶底，然后用滴管吸盡舊液（棄去） 2. 加入PBS1~2ml，輕輕搖晃，然后用滴管吸盡舊液（棄去） 3. 加入約1~1.5ml胰酶，室溫或培養(yǎng)箱中放置4~5分鐘，直到所有貼壁細(xì)胞消化下來為止【判斷方法：倒置相差顯微鏡觀察，細(xì)胞變圓時就可以終止消化】 4. 加入約1ml培養(yǎng)基（含有小牛血清）終止消化 5. 用滴管吹洗一次，移入離心管, 800轉(zhuǎn)/min，5分鐘離心 6. 加入培養(yǎng)基，吹打分散細(xì)胞，再根據(jù)分傳細(xì)胞瓶數(shù)補加一定量的含血清的培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液；分裝至2~3個培養(yǎng)瓶中 7. 放入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng) 細(xì)胞計數(shù) 1. 準(zhǔn)備好顯微鏡、載玻片、蓋玻片、血細(xì)胞計數(shù)板、吸管等儀器設(shè)備 2. 按照“細(xì)胞傳代”中講述的方法制成細(xì)胞懸液 3. 將細(xì)胞懸液取出若干，滴入血細(xì)胞計數(shù)板，注意不要有氣泡進入 4. 加樣后靜置2~3min后觀察，數(shù)四角大格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。計數(shù)時應(yīng)按照一定的路徑，以免遺漏或重復(fù)。細(xì)胞壓線時計上不計下，計左不計右，計數(shù)2~3次，取平均值 5. 細(xì)胞密度 = 四大格中細(xì)胞總數(shù)÷4 ×104 = 細(xì)胞數(shù)/ml懸液 細(xì)胞凍存 1. 重復(fù)“細(xì)胞傳代”中的消化細(xì)胞的步驟，將細(xì)胞消化下來，轉(zhuǎn)移至離心管800轉(zhuǎn)/min，5分鐘離心，棄液 2. 沉淀中加入凍存液，輕吹制成懸液 3. 分轉(zhuǎn)到凍存管內(nèi)，每個1~1.5ml 4. 將凍存管口封嚴(yán) 5. 貼上標(biāo)簽，注明凍存時間、細(xì)胞種類及代數(shù) 6. 按下列順序降溫，并最終凍存：室溫→ 4℃ 20min → -20℃ 30min →-70℃凍存 |
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