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gentledragon金蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助】肝微粒體不代謝--急死人啦 已有5人參與
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求教肝微粒體體外代謝實(shí)驗(yàn)問題： 我從sigma訂購的鼠肝微粒體M9066，NADPH，按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法試驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)檢測不到代謝產(chǎn)物，底物量也不見減少。請同道中人指教，不勝感激！ 為了鑒定烏頭堿的體外代謝產(chǎn)物，0.5ml反應(yīng)體系含150mM Tris-HCl 緩沖液（pH=7.4），5mM MgCl2， 1mg/ml 微粒體蛋白和40uM烏頭堿，反應(yīng)體系在37度預(yù)孵育3分鐘后，向體系中加入50uL NADPH（20mM/L）啟動(dòng)反應(yīng)，震蕩水浴上孵育60分鐘，而后向體系中加入4mL冰冷的二氯甲烷終止反應(yīng)，渦旋震蕩后4500g離心10分鐘，取有機(jī)相3.5mL氮?dú)獯蹈�，而后�?50uL流動(dòng)相溶解進(jìn)樣。 按此法操作后，并未像文獻(xiàn)中報(bào)道的那樣發(fā)生代謝，而后改進(jìn)緩沖液，即向緩沖液中加入甘油/EDTA/DTT，仍未見代謝發(fā)生，又有人說向體系中飽和氧氣會(huì)好些，依法做后仍未見代謝，遂求高人指教！ |
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5樓2010-01-12 21:31:30
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