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黑妞0132銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
【求助】LH-20葡聚糖凝膠該如何裝柱子 已有15人參與
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| 剛買(mǎi)的100gLH-20葡聚糖凝膠，該如何裝柱子？先要用甲醇泡嗎？還是用水泡？泡到啥程度裝柱子？要裝多大的柱子？請(qǐng)高手指點(diǎn) |
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karl2100(金幣+1):謝謝提供！ 2010-04-02 00:36
黑妞0132(金幣+1):謝謝指導(dǎo) 2010-04-05 12:36
黑妞0132(金幣+2):寫(xiě)的太棒了 2010-04-05 12:43
karl2100(金幣+1):謝謝提供！ 2010-04-02 00:36
黑妞0132(金幣+1):謝謝指導(dǎo) 2010-04-05 12:36
黑妞0132(金幣+2):寫(xiě)的太棒了 2010-04-05 12:43
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1 Sephadex LH20是一種價(jià)錢(qián)較高的填料，使用請(qǐng)千萬(wàn)注意，很貴的喲！ （當(dāng)然，老板有錢(qián)就另當(dāng)別論拉） 2 先講Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分離原理主要有兩方 面：以凝膠過(guò)濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因?yàn)槟z 過(guò)濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，小分子的化合物保留 強(qiáng)，最后出柱。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH20對(duì)化合物還起反相 分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，極性小的化合物保 留強(qiáng)，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過(guò)濾作用來(lái)分離。 3 再講Sephadex LH20 洗脫溶劑。聽(tīng)我講完 第2點(diǎn)后，其實(shí)就應(yīng)該清楚Seph adex LH20 洗脫溶劑因分為兩類(lèi)：反相和正相兩種。用得最多的是反相溶劑 洗脫，以甲醇－－水系統(tǒng)最為常見(jiàn)，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用10 0％甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以氯仿－－甲醇最為常見(jiàn)，先用50％氯仿－－甲醇， 逐漸增加甲醇比例，最后用100％甲醇沖柱。 4 接下來(lái)講樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。如果樣品極性大，這選用反相溶劑 洗脫（甲醇－－水），樣品用最少體積的甲醇－－水（盡可能甲醇少一些）溶 解，過(guò)濾后，濕法上樣（一定要濾喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得將 Sephadex LH20 的柱頭部分棄去，很心痛呀）。如果樣品極性小，這選用正 相溶劑洗脫（氯仿－－甲醇），樣品用最少體積的氯仿－－甲醇溶解，過(guò)濾 后，濕法上樣。 5 分離的技巧，最后說(shuō)說(shuō)我的使用心得 （1） 流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達(dá)。 （2）柱子盡可能長(zhǎng)， Sephadex LH20 柱長(zhǎng)的增加將極大地改善分離，所不 要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。所 謂集中優(yōu)勢(shì)兵力，打擊敵人。 （3） 餾分一定要接的細(xì)，可1／10，或1／20 個(gè)保留體積接成一餾分。 （4） 洗脫體積一般為2-3個(gè)保留體積，對(duì)特殊保留強(qiáng)的化合物，可洗脫5個(gè)保 留體積。 （5）鞣質(zhì)成分死吸附嚴(yán)重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣質(zhì) （6）Sephadex LH20 對(duì)黃酮類(lèi)成分的分離效果極佳，方法很成型，有大量 文獻(xiàn)參考。 （7）填料反復(fù)使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分 離的起步溶劑將甲醇替換出來(lái)，待用。 |
5樓2010-04-01 23:20:47
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karl2100(金幣+1):多謝提供！ 2010-03-26 22:24
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新買(mǎi)的凝膠使用前一般是要溶脹的，考慮溶脹系數(shù)，1g凝膠水溶脹2.1ml，甲醇溶脹1.9ml，氯仿溶脹1.6ml，不能用丙酮或乙酸乙酯溶脹（會(huì)使凝膠收縮嚴(yán)重）。可以用蒸餾水按上述比例溶脹，置室溫下3h。 凝膠層析柱的直徑與柱長(zhǎng)之比一般為1：15，柱的底部用洗凈的玻璃絲墊底（也可棉花），先可加入1/3柱體積蒸餾水，接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊連續(xù)裝入，使它們自然沉降，同時(shí)打開(kāi)下口慢速流出蒸餾水，柱子必須均勻，沒(méi)有氣泡和條紋，裝好后，可以用蒸餾水平衡2-3h，即可使用。 |
2樓2010-03-26 19:34:07
kangroo-no1
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4樓2010-03-28 16:30:53
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6樓2010-04-02 14:01:05
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7樓2010-04-02 19:33:24
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8樓2010-04-02 21:00:34
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9樓2010-04-03 10:07:36
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10樓2010-04-03 18:00:54
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