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jingcp200320銀蟲 (小有名氣)
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【分享】高人整理的細(xì)胞總蛋白的提取 已有17人參與
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細(xì)胞總蛋白的提取 一．懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)107重懸于0.5mlPBS(0.01M)中，加入飽和濃度一抗(1/10)或 （10ug/ml）4℃15-30min后，短暫離心4000 轉(zhuǎn)×3分，用PBS 0.4-0.5ml重懸(室 溫),加入飽和濃度二抗（1/100）或 (20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后 （迅速加入終止液0.5ml（冷pbs中含有400uM Na3VO4 ,5mM EDTA,10mM NaF））, 離心4000 轉(zhuǎn)×3分，棄上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解濃度 108/ml？)吸管輕輕混勻，冰點(diǎn)緩慢震搖孵育30分鐘后加入10ul濃度為10mg/ml 的PMSF儲(chǔ)存液，冰點(diǎn)孵育30分鐘。4度離心15000g 20min。上清液即為全部細(xì) 胞溶解成分。 二．裂解緩沖液： 50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4 150-300mM NaCl 1％(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100) 5mM EDTA（現(xiàn)加1ml加10ul） 臨用前加入蛋白酶抑制劑： Na3VO4 釩酸鈉 1mM (75mM—13.3ul/ml) （用0.2mol/L儲(chǔ)存液配制） PMSF苯甲酰氟 1mM (10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml) 或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加10-20ul） Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml（10ul/ml） (Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加) Western blotting 三．給你介紹一個(gè)裂解液： 50mM Tris-HCl （PH8.0）緩沖液，含： NaCl 150mM 疊氮鈉 0.02% SDS 0.1% NP-40 1% PMSF 100ug/ml（使用前臨時(shí)加入）(10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml) 盡量用少的裂解液裂解細(xì)胞，取上清電泳，最好用6xSDS 上樣buffer。 四．我的樣品蛋白是這樣制備的： １．將與腺病毒轉(zhuǎn)染液共培養(yǎng)２４小時(shí)的細(xì)胞消化下來 ２．離心收集細(xì)胞 ３．向離心管里加入４０微升１×PBS 緩沖液，隨后再加入４０微升2×Lamily buffer （由tris堿和SDS 組成）裂解細(xì)胞 ４．將細(xì)胞裂解液放入沸水中加熱五分鐘，放冷后離心． ５．測(cè)定蛋白濃度，加樣電泳 我所說的前沿有蛋白是指膠的底端，不是指加樣孔下面有蛋白．膠的濃度應(yīng)該沒 問題。 五．碧云天公司技術(shù)支持 Western 及IP 細(xì)胞裂解液的主要成分為20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及焦磷酸鈉, β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin 等多種抑制劑。可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。(-20 ℃保存，一年有效。) 如果是貼壁細(xì)胞，按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即細(xì)胞培養(yǎng)液量 的1/20）加入裂解液。 六．軍科院技術(shù)支持 裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100ug/ml PMSF）： 1mol/L Tris?HCl（pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX－100 0.5ml 蒸餾水至 50ml 混勻后， 4℃保存。使用時(shí)，加入PMSF 至終濃度為100ug/ml（0.87ml 裂解液 加入1.74mg/ml PMSF50μl）。 七．操作方法： 蛋白樣品制備： （1） 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取： 1、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖?br /> 一會(huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。 2、每瓶細(xì)胞加 3ml 4 度預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min 洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將 PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。 3、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無 結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。） 4、每瓶細(xì)胞加400 ul 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂 解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。 5、裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍 將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml 離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。） 6、于 4度下12000rpm 離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷） 7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min 的離心管中放于－20 度保存。 |
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