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[交流]
【求助/交流】植物細(xì)胞膜蛋白提取 已有2人參與
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| 請(qǐng)問(wèn)各位蟲友，有誰(shuí)提取過(guò)植物細(xì)胞膜蛋白？用什么方法最好？謝謝 |
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wuweibewin
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 673.3
- 散金: 195
- 紅花: 8
- 帖子: 634
- 在線: 42.8小時(shí)
- 蟲號(hào): 738179
- 注冊(cè): 2009-04-02
- 性別: GG
- 專業(yè): 作物分子育種
本實(shí)驗(yàn)室就是這么做的
★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
plantaqp(金幣+3): 2010-04-29 04:32
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
plantaqp(金幣+3): 2010-04-29 04:32
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植物質(zhì)膜提取與純化 一、試劑 Hepes，Tris，MES，EDTA，山梨醇，PSFM，BSA，均購(gòu)于北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)公司。 研缽，研槌，玻璃勻漿器，紗布，高速離心機(jī)，超速離心機(jī)，離心管（50mL），超速離心管（26mL）. 二、操作步驟 1．質(zhì)膜粗提 1）組織20g (fw) 液氮研碎 2）轉(zhuǎn)入預(yù)冷研缽（4度） 3）加入冰浴勻漿液 50ml （勻漿液：Hepes-tris 20 mM pH 7.8, EDTA 1 mM pH 8.0, 山莉醇0.25 M, PMSF 1mM，BSA 0.5%,） 4）冰浴勻漿5 分鐘 5）過(guò)濾 （3層紗布） 6）濾液10000g 4度離心15分鐘 7）上清 80000g 4度40 min 8）沉淀小體積2毫升懸浮. 懸浮液：Hepes-tris 20 mM pH 7.8, EDTA 1 mM pH 6.0. 9）玻璃勻漿器勻漿數(shù)次 2．用兩相法進(jìn)一步純化 1) 兩相系統(tǒng)：精確配制 PEG 3350 6.4% (w/w), 葡聚糖500 6.4% (w/w), 山莉醇 0.25 M MES 5 mM pH 6.0 2) 粗質(zhì)膜懸液1/15（v/v）與兩相系統(tǒng)混合(輕) 3）4 度1000g 5 分鐘。 4）上清再與兩相系統(tǒng)液混合 5）4 度1000g 5 分鐘。 6）上清再與兩相系統(tǒng)液混合 7）4 度1000g 5 分鐘 8）收集上清。 3．純質(zhì)膜懸液 1)上清稀釋3倍 (稀釋液：MES 5 mM pH 6.0, 山莉醇 0.25 M) 2) 120000 g 離心 40 分鐘 4度。 3）沉淀小體積300微升懸浮 （懸浮液MES 5 mM pH 6.0, 山莉醇 0.25 M) 三、注意事項(xiàng)： 1． 一切操作均在低溫下進(jìn)行。 2． 兩相系統(tǒng)配制要精確。 3． 相轉(zhuǎn)移時(shí)要輕吸輕放。 4． 懸浮質(zhì)膜體積盡量小，且至少洗滌三次管底。 |
2樓2010-04-28 09:18:37
3樓2010-04-28 17:16:01
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