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zcqcau鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[交流]
【求助/交流】酵母基因的插入和取代 已有4人參與
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| 運(yùn)用何種方式能最大程度的使外源基因插入或者取代酵母基因的AOX或者His，從而使基因整合進(jìn)基因組？？謝謝 |
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木蟲 (正式寫手)
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scelab(金幣+2):歡迎多來交流！:tiger06: 2010-05-18 22:26:21
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| 把已知基因轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞,并且整合到基因組中得到穩(wěn)定表達(dá)的技術(shù),稱為基因?qū)�。它是改變物種遺傳性狀的最根本途徑。要把基因?qū)爰?xì)胞,首先要把細(xì)胞克隆化。目前已經(jīng)得到了若干真核細(xì)胞克隆化基因,如β-珠蛋白基因,TK基因等。利用顯微鏡操作把這些基因注入到小鼠受精卵的原核中,再把受精卵植入到生殖管道中,發(fā)育成的個體不僅能表達(dá)注入基因決定的性狀,而且能把該基因傳到第二代。這方面最成功的例子是“超級小鼠的誕生。這些小鼠生長快,74 d時的體重就接近同窩正常小鼠的兩倍。這一成果的意義不僅為遺傳工程和遺傳疾病(如巨人癥)的研究提供了模型,而且也為加速經(jīng)濟(jì)動物的生長提供了新的技術(shù)途徑。 1 物理方法 1.1 DNA直接注射法: 是目的基因?qū)氲淖詈唵畏椒? 但注入量有限, 能夠接觸到的腫瘤細(xì)胞有限,故獲得的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化率很低, 多通過腫瘤局部多點(diǎn)注射給藥。 1.2 顆粒轟擊技術(shù):將目的基因包被金屬以后,利用高壓發(fā)射裝置, 加速包裹目的基因的金屬顆粒進(jìn)入細(xì)胞,從而提高腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。 2 化學(xué)方法 即用化學(xué)方法構(gòu)建非病毒載體系統(tǒng)，借之完成基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。主要包括以下兩種。 2.1 脂質(zhì)體載體：方法具有安全、簡單、低毒、無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，適用于注射方法進(jìn)行器官靶向性轉(zhuǎn)移并有一定的轉(zhuǎn)移效率。是除病毒載體轉(zhuǎn)移方法之外的另一種有價值的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方法。多用于體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞，或通過瘤組織內(nèi)注射［1］進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)化,并已有少數(shù)臨床應(yīng)用的報(bào)告。目前常用的是陽離子脂質(zhì)體(商品名為Lipofectin)。它可自發(fā)的與DNA形成復(fù)合物，保護(hù)外源DNA不被核酸酶降解，具有制備簡單、安全無毒、無免疫原性、重復(fù)性、對基因片段大小無限制且轉(zhuǎn)染操作方便等優(yōu)點(diǎn)。由于它可與細(xì)胞膜直接融合而能有效地避免溶酶體破壞，故遠(yuǎn)比傳統(tǒng)的脂質(zhì)體效率高。缺點(diǎn)是靶向性有限。Nishikawa等［2］從BALB/c小鼠的尾靜脈注射以熒光素酶基因?yàn)閳?bào)告基因的質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物， 發(fā)現(xiàn)肺、肝、脾等器官組織中都有熒光素酶基因及其產(chǎn)物，持續(xù)表達(dá)超過3個月。常規(guī)脂質(zhì)體易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)細(xì)胞攝取，在巨噬細(xì)胞本身可成為靶細(xì)胞的部位，RES的這種親合性是有利的。Hasegawa等［3］采用日本血凝病毒( hemagglutinating virus of Japan , HVJ)脂質(zhì)體為載體，用HSV-tk/Gcv系統(tǒng)治療肝癌發(fā)現(xiàn)，在體外試驗(yàn)中當(dāng)Gcv的濃度100microg/ml時幾乎所有腫瘤均被殺死，甚至當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)率只有20％時，也有1/3腫瘤被消滅。此方法重復(fù)應(yīng)用效果更佳，且皮下注射未見明顯的炎癥反應(yīng)。 2.2 受體介導(dǎo)法：利用肝細(xì)胞上富含轉(zhuǎn)移因子和糖蛋白受體的特點(diǎn)，人工合成多聚陽離子氨基酸，進(jìn)而連接轉(zhuǎn)移因子(或糖蛋白)和目的基因構(gòu)成復(fù)合物，通過與肝細(xì)胞表面的受體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移。此法靶向性好，但受體介導(dǎo)的內(nèi)吞小泡會被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，易被溶酶體降解而造成目的基因表達(dá)時間短暫，表達(dá)效率低下。利用氯哇抑制溶酶體酶或腺病毒與內(nèi)吞小泡相融合而將其破壞釋放出外源DNA，可提高轉(zhuǎn)化效率。 3 生物學(xué)方法 主要通過構(gòu)建病毒載體來完成。 3.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus，Rv):構(gòu)建簡單，裝載外源基因容量最大達(dá)8kb，整合入宿主細(xì)胞基因組而無病毒蛋白表達(dá)。但僅能感染分裂期細(xì)胞，體外制備滴度較低，且其隨機(jī)整合有引起“插入性突變”的可能［4］。 3.2 腺病毒(adenovirus, Adv): 為近年肝細(xì)胞肝癌基因治療中報(bào)告最多的一種病毒載體［5］。體外制備滴度較大 ，裝載外源基因容量最大達(dá)35kb，不整合入宿主細(xì)胞基因組因而避免插入突變的危險(xiǎn)，能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞。但易引起宿主免疫反應(yīng)而使轉(zhuǎn)染效率下降，且大劑量靜脈給予可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟炎癥反應(yīng)，因此通過全身給藥受到限制。Nagao等［6］發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)注射重組Adv后，目的基因可有效表達(dá)，但表達(dá)時間短暫，重復(fù)注射后表達(dá)效率降低且誘發(fā)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。 3.3 單純皰疹病毒：單純皰疹病毒(herps simplex virus，HSV)對非分裂細(xì)胞有天然的親合力，裝載外源基因容量達(dá)30kb，體外制備滴度接近腺病毒。但構(gòu)建時難以除去與裂解細(xì)胞有關(guān)的基因而對細(xì)胞毒性大［7］。 3.4 腺相關(guān)病毒：腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)在人類不引起任何病理性后果，它能感染非分裂S相細(xì)胞，還能將基因轉(zhuǎn)人非周期(noncyling)腫瘤細(xì)胞。AAV是一種缺陷前病毒，對人類無致病性。能用于運(yùn)載外源性重組基因組，已應(yīng)用于肝和肝癌細(xì)胞的治療基因轉(zhuǎn)移［8］。 3.5 其他病毒：痘苗病毒［9］(vaccini virus)可以獨(dú)立在細(xì)胞之中復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并能以較強(qiáng)的方式表達(dá)多個腫瘤抗原。桿狀病毒［10］(bacul virus)能夠感染肝細(xì)胞和肝腫瘤細(xì)胞，并能增強(qiáng)肝細(xì)胞腫瘤壞死因子a(TNFa)、IL-1a、IL-lβ的表達(dá)。 |
2樓2010-05-18 21:21:43
fungixx
至尊木蟲 (文壇精英)
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3樓2010-05-19 09:19:14
zcqcau
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4樓2010-05-19 12:00:56
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5樓2015-04-27 22:33:17
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