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liangyanpeng金蟲 (正式寫手)
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【求助】求助實(shí)驗(yàn)方案 已有2人參與
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| 葡萄糖氧化酶的酶活怎么檢測��？ |
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木蟲 (正式寫手)
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測酶活性的實(shí)驗(yàn)： .用萃取化學(xué)公司法（Amano法的改進(jìn)型）測定葡萄糖氧化酶 （1）試劑 ① 磷酸鹽緩沖液（pH7.0）：取6.805g磷酸二氫鉀(KH2PO4; Merck, Art.4873)溶于350mL蒸餾水中。用1M氫氧化鈉溶液(NaOH (4g溶于100ml水))將pH值調(diào)至7.0，用蒸餾水定容至500mL。 ② 鄰-聯(lián)二茴香胺(o-Dianisidine)溶液：取1.7mg鄰-聯(lián)二茴香胺（C14H16N2O2; Serva, Nr,19175）溶于25ml磷酸鹽緩沖液。 ③ 過氧化物酶（辣根過氧化酶，181U/mg）溶液（約0℃）：取1.7mg過氧化物酶（Serva, Nr,31943）溶于5ml蒸餾水。每毫升此溶液中應(yīng)含有60個(gè)紅紫倍精單位。 ④ 底物溶液（約0.55M）：取5.0gβ－D－葡萄糖（C6H12O6; Sigma, No.G-5250）溶于蒸餾水中，定容至50mL。 使用前，至少得將此酶靜置3h。 ⑤ 酶（待測的葡萄糖氧化酶）溶液：用磷酸鹽緩沖液溶解該酶。1mL配制的酶溶液中應(yīng)含有大約0.1U。 0.0037g溶于500μl PBS, 再取10μl前者溶液定容至100PBS（約0.1U/ml）。 測酶活性（118U/mg）的實(shí)驗(yàn)2 （1）操作步驟：將0.50mLβ－D－葡萄糖溶液、0.10mL在冰水中冷卻過的過氧化物酶（辣根過氧化酶）溶液和2.4mL鄰-聯(lián)二茴香胺溶液滴入一只小燒杯內(nèi)混合，調(diào)溫至25℃，然后將其全部加到1cm的比色皿內(nèi)，最后加0.1ml酶于待測的葡萄糖氧化酶溶液，同時(shí)按動(dòng)秒表。在連續(xù)15min內(nèi)每隔1min于436nm處測一次吸光度 (2)計(jì)算：用以下公式計(jì)算活性： 式中：E436――每分鐘吸光度的變化（436nm處）(15次的平均值) Ew――0.1ml所用酶液中含酶的重量（0.000074mg） 8.3――1μmol鄰-聯(lián)二茴香胺/mL的吸光度（436nm處） 3.1――反應(yīng)混合物的總體積 U1=53.25U/ mg; U2=93.21U/ mg; U3=13.30U/ mg 測酶活性（118U/mg）的實(shí)驗(yàn)5(061218) （1）操作步驟：將333μlβ－D－葡萄糖溶液、67μl在冰水中冷卻過的過氧化物酶（辣根過氧化酶）溶液和1.6mL鄰-聯(lián)二茴香胺溶液滴入一只1cm的比色皿內(nèi)，調(diào)溫至25℃，最后加67μl酶于待測的葡萄糖氧化酶溶液，攪拌均勻(攪拌同時(shí)計(jì)時(shí)，共用8s，)，然后重新按動(dòng)秒表。在連續(xù)15min內(nèi)每隔1min于436nm處測一次吸光度 (2)計(jì)算：用以下公式計(jì)算活性： 式中：E436――每分鐘吸光度的變化（436nm處）(15次的平均值) Ew――67μl所用酶液中含酶的重量（0.00004958mg） 8.3――1μmol鄰-聯(lián)二茴香胺/mL的吸光度（436nm處） 2.067――反應(yīng)混合物的總體積 GOD: 15min的平均值： U1=181.23U/mg; U2=167.36U/ mg; U3=156.11U/ mg 4min的平均值： U1=156.56U/ mg; U2=129.89U/ mg, U3=134.97U/ mg http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20060629/470655/ |
2樓2010-06-02 22:14:58
liangyanpeng
金蟲 (正式寫手)
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3樓2010-06-22 16:10:37
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